摘要

前言

研究結果

研究人員從代表了不同的發育時間和組織位置的17個單獨的胚胎中收集了77個腸道樣本繪制成單細胞圖譜 （Figures 1?A和1B），數據集范圍從8到22 PCW，跨越隱窩形成之前的時間點，直至成人狀絨毛/隱窩形態的發展（FiguresS1A）。使用寡核苷酸標記抗體，產生了76,592個細胞 (Figures 1A 和 S1B–S1I; STAR methods)。

聚類分析將這些細胞分為9個腸道小室，以轉錄特征分別標注-上皮細胞，成纖維細胞，內皮細胞（EC），周細胞，神經（ENS），肌瘤，間皮，肌成纖維細胞和免疫(Figures 1C 和 1D)，且具有明顯的區位和發育時間差異(Figures 1E 和 1F)。基于關鍵標記基因進行的精細聚類注釋進一步確定了區室中的101個亞群，并利用基于圖的劃分抽象方法描述了它們之間的關系(Figure 1G; Table S1;STAR methods)。接下來，對轉錄因子(TF)調控網絡進行映射，以突出每種細胞類型的關鍵調控網絡，并重建細胞命運的“決策樹”(Figure S2A; STAR methods)。鑒定出了464個TF模塊(如上皮細胞發育中的ARID3A（FDR<2.2e-16、coeff= 0.350），成纖維細胞中TCF21 （FDR<2.22e-16, coeff = 0.299），概述了已知的發育調節劑（例如用于腸內分泌細胞[EEC]分化的PAX4）以及306個發育發育階段和44個不同位置的調控網絡（例如，回腸末端的FOXD1?（FDR <2.22e-16，coeff = 0.026）(Figure S2B)。同樣，繪制了所有101種細胞類型之間的串擾圖，確定了成對細胞群之間的假定受體-配體（RL）相互作用（每個簇對多達179個旁分泌相互作用，包括2,252個RL對）(FigureS2?C;?STAR methods）。

對跨腸發育的組織進行空間轉錄組分析（5個樣品中的8個切片; 12 PCW，n = 5; 19 PCW，n = 1;成人，n = 2）（Figure 1A）。ST斑點的轉錄特征分析確定了每張幻燈片中的5-13個斑點簇，它們映射到離散位置(Figure2A)。使用單細胞圖譜作為參考，利用因子分析來確定每個斑點可能的scRNA-seq組成，從而在空間上定位所有scRNA-seq簇。與此同時，利用成人上皮細胞進行scRNA-seq預測了成人和胎兒的空間細胞類型分布（GEO：GSE116222，GSE125970），基質(GEO: GSE114374) 和免疫(DUOS-000110) 。

來自成年細胞群體（如隱窩頂部結腸細胞和成肌纖維細胞）的轉錄組學特征也位于適當的解剖位置（Figure2B）。RET顯示在肌間神經叢和粘膜下淋巴濾泡的PTPRC（CD45）有斑點特異性表達（Figure 2B）。

成對細胞類型信號相關性分析強調了幾種細胞類型（如，BEST4 / OTOP2細胞和結腸細胞）的顯著同點共現，與預期的原位細胞定位一致（Figure2Ci）。大多數ST斑點簇是分層分布的，突出了與組織深度相對應的轉錄/細胞空間變異性的*大決定因素。

研究人員鑒定了2,893個與深度相關的基因（<5％FDR），反映了不同層次的活躍途徑(Figure Cii) -肌肉/神經過程(收縮/軸突形成)向吸收管腔功能(微絨毛組織和消化系統過程)發展的深度富集點，與細胞類型特征的順序富集相符（Figure?2Ciii）。在胎兒ST顯著的差異包括外肌層和內肌層在19個PCW時占據離散的空間層，而不是12個PCW時(Figure 2D)。

子宮上皮隱窩的形成建立了維持粘膜屏障的終生回路。該研究捕獲了17,622個上皮細胞，這些上皮細胞易于區分其吸收性（腸上皮細胞和BEST4/OTOP2細胞），分泌性（EEC，杯狀細胞和分泌性祖細胞），未分化（遠距離擴增[TA]和近端TA）以及干細胞（近端和遠端ISC）基因標簽（Figure 3A；Table S1）。吸收性細胞基因的表達反映了類似于成人上皮的成熟光譜。研究人員觀察到由高特異性基因表達（例如CCL25和APOE）（Figure3A和3B）劃定的近端（小腸[SI]）和遠端（結腸）樣品之間的位置差異很大，通過軌跡分析和幾個TF模塊進行了證實（FigureS3一種）。這表明，在隱窩形成之前，位置特異性轉錄程序就已經建立起來了。

研究人員觀察到近端和遠端ISCs隨著時間的推移逐漸增加。這與ISC轉錄程序的早期位置差異形成對比，例如遠端LEFTY1和近端FOXD1及其下游調控網絡基因（Figure3C，3D和S3B）。這些差異由關鍵的位置信號轉通路支撐，例如，結腸LEFTY1通過激活素A受體（ACVR2B）參與了假定的神經相互作FigureS3?C1）。在早期發育中（<12 PCW），研究人員發現了近端上皮干樣祖細胞群，該細胞群發展為早期腸上皮細胞。這些細胞表現出許多原始功能，包括在中胚層分化重要的VTN基因高表達，與ISCs相比，LGR5表達較少，和ONECUT2表達參與上皮發育（Figure 3B和FigureS3?D）。這些細胞在SI中特異表達TF GATA4(Figure3Ei)， SI是一種小鼠早期內胚層調節因子，在12 PCW后，其表達大部分丟失這些細胞高表達轉鐵蛋白(TF)( Figure3B和3F)，證實了鐵代謝在絨毛形成中的重要性。LGR5是一種典型的ISC基因，在妊娠早期(<12 PCW)的近端/遠端廣泛檢測到低水平ISCs和干樣祖細胞（Figure3B和FigureS3D）。原位雜交（ISH）證實了在10PCW處彌漫的LGR5表達，后來定位于隱窩堿基（Figure3G），類似于在雞和小鼠發育中報道的Lgr5的行為。即使在隱窩形態建立之后（如19 PCW之后），ISC仍分別構成遠端/近端樣本中捕獲的上皮細胞的18％–22％（Figure3C），高于成人結腸的scRNA-seq研究捕獲的3%-4%。與此相符，研究人員發現ASCL2?TF模塊（包括下游目標LGR5）隨著發育時間的增加而顯著增加（Figure3H）。

分泌型譜系細胞在12 PCW時出現，在8-10 PCW時檢測到很少的杯狀細胞。然而，12 PCW后的杯狀細胞和EEC逐漸增加，反映出持續的成熟（Figure3A和S3E）。分泌細胞進一步細分為11個簇，反映了不同的EEC亞型（A/M，D和腸嗜鉻/I/L/N細胞）以及SI特異性Paneth細胞，杯狀細胞和NEUROG3?+祖細胞群（FigureS3?F;TableS1）。與其他EEC亞型不同的是，較早檢測到Paneth細胞旁邊的I細胞和A細胞（FigureS3F）。RL映射建立了核心EEC信號通路，如腸嗜chromaffin細胞，常見于結腸12pcw，通過多種途徑與抑制性運動神經元相互作用，包括TPH1-HTR2B，一種已知的食欲/運動中的5 -羥色胺信號通路(Figure S3Cii)。因此，隨著隱窩的形成，EEC多樣性和相關網絡在很大程度上得以建立。

相比之下，BEST4/OTOP2細胞在隱窩形成之前的時間點出現，轉錄水平已經不同(Figure 3I)，并且隨著時間的推移頻率沒有變化(Figure S3Gi)，這表明它們的發育可能與正常的隱窩-絨毛回路無關。此外，RL分析預測BEST4/OTOP2與神經元細胞之間有很強的相互作用(同樣在發育早期建立);例如，抑制性運動神經元表達神經遞質VIP，通過受體VIPR1的表達介導分泌BEST4 / OTOP2細胞(Figure S3Gii)。

腸道發育需要三種胚層細胞類型之間的√確相互作用。研究人員鑒定了8個部分的78個非上皮細胞簇，根據它們的轉錄、時間和位置分類(16個成纖維細胞，4個肌成纖維細胞，2個間皮細胞，12個上皮細胞，8個周細胞，13個神經細胞，12個免疫細胞，11個肌肉細胞) (TableS1)。在這些細胞中，觀察到協調的分化動態，一些群體首先發生變化，從而可能建立關鍵的生態位，為其他細胞鋪平道路，而在其他細胞群中，共定位群體則同步進化。

轉錄標簽通常對應于結構特征。在EC中可以清楚地看到這一點，將EC分為靜脈，動脈和淋巴管類型，并通過血管大小進一步區分（Figure4?A；TableS1）。在發育過程中，觀察到了從小血管到大血管的過渡，反映了腸道血管生成（Figure S4?A）。確定了驅動這種變化的TF網絡，例如動靜脈分化器HEY1和SOX13。成年ST的脈管系統很容易識別成年EC和胎兒EC信號（Figure S4?B）。與EC相對的，周細胞亞型由血管生成驅動因子（PRRX1，THBS4和ANGPT2）定義（Figure 4?B；table S1）。ANGPT2是EC-周細胞RL相互作用的關鍵調節因子，已證實其位于胎兒脈管系統中（Figure S4C）。盡管EC隔室與8 PCW處存在的大血管細胞截然不同，但周細胞種群顯示出發育滯后。為了了解這些分化動力學，研究人員將G2M和S期周細胞與G1期細胞進行了比較，發現在較早時間點的大多數細胞是高度循環的祖細胞（Figure S4?D）。這些種群與成纖維細胞和原始的ACTA2?+細胞共享轉錄特征，這一結果受到軌跡分析的支持（Figure S4?E）。綜上所述，提出了早期成纖維細胞向周細胞的轉變，然后是來自未成熟WNT6表達細胞的第二波周細胞增殖-分化。16 PCW時，成熟的成肌纖維細胞表現出相似的發育滯后（Figure 4?Ci；table S1）。文獻表明腸道成肌纖維細胞可能來自多種來源，并且圖形抽象顯示成熟的成肌纖維細胞類似于肌肉細胞，在特定基因（例如RSPO2，Figure 4?Cii）中存在明顯差異。然而，肌成纖維細胞祖細胞卻表現出來自成纖維細胞和周細胞的梯度譜;在19 PCW的ST中，它們占據了與過渡間質細胞相鄰和重疊的層。（Figure 4?D和S4?E）。

與PCW7-8晚期發展出現的細胞類型相反，腸神經嵴來源的細胞沿胃腸道的長度遷移，進入包含神經元和膠質細胞的粘膜下和肌間神經叢。本研究的時間點（Figure4E）確定了不同的神經元和神經膠質祖細胞，并捕獲了5個神經膠質細胞和7個神經元簇（FigureS5 Ai；tableS1）。除了RL分析突出的不同ENS通路（圖S3C），同時還表明ENS與其他部分相比相對成熟。在ST中，ENS成分也被清楚地看作是肌間神經（FigureS5 Aii）。

在成年腸道中，神經元叢被肌肉包圍。祖細胞和分化的腸平滑肌細胞（iSMCs）分別由PLPP2和ACTA2等基因標記（Figure4 F;TableS1）。本研究確定了11個與iSMC相關的簇，包括PDGFRA +間隙細胞和Cajal間隙細胞的早期種群（FigureS5 B）。通過10 PCW觀察到內（IM）和外（OM）肌肉的形成。這些層在胎兒腸中的發育順序尚不清楚，有相互矛盾的報道表明兩者同時發育或IM首先發育。與前者一致，觀察到分化浪潮，結腸肌層滯后于較成熟的近端組織，早期樣品以祖細胞為主，而分化的遠端肌層粘膜（MM），OM和IM細胞在12歲后大量出現PCW（FigureS5 C）。在19 PCW處而非12 PCW處的結腸ST中，肌肉層是分開的并且在視覺上是不同的（FigureS5D）。確定了描繪肌細胞的關鍵TF網絡。KLF7在肌肉中，TWIST2在間質細胞和OM細胞中（FigureS5E）。FOXF2在IM中具有特異性活性（Figure4F），這與前期的小鼠相關報道一致。此外，據報道，Foxf2 -/-小鼠胚胎致死，伴隨有薄壁結腸，腸神經元數量減少，扁平的上皮細胞和未發育的成纖維細胞。這一發現與平滑肌介導的機械力是引發絨毛形成的可能性相吻合。

發育中腸道內不同的室間由間充質細胞支撐，間充質細胞是腸內*大的室間（24,081個細胞）。基于成人scRNA-seq中建立的命名法將成纖維細胞命名為stromal-1-4 (S1-S4)亞型。根據時間，位置和周期的差異進一步將它們細分為16個類（Figure 4 G；Table S1；STAR方法）。S1細胞的3個簇形成了黏膜下層結構細胞的主體，而S2細胞（由F3，NPY和FOXL1標記）表達的標志物與隱窩周圍的細胞群相似，對上皮的發育和形成至關重要（Figure S6 A）。與成人相比，S3-like細胞不僅在子宮內形成了一個主要的成纖維細胞群，而且表現出更大的異質性。一些S3簇具有高表達的原始標記(HAND1、WNT4和DLK1)，以及成人標記S3基因(C7和CCDC80)。軌跡分析確定了一個分支點，未成熟的S3-like細胞分裂為S3或S1/2/4譜系，這些譜系可以被譜系特異性的TF網絡(如NR2F1)分化，NR2F1也在肌成纖維細胞中表達。研究人員發現S3-like祖細胞在增殖室中高度富集，表明這些細胞可能在這一時期產生大量分化成纖維細胞。

為了更好地理解S3亞型功能，研究人員研究了RL互作，注意到與EC的大量串擾預測（FigureS6D）。其中許多是通過調節結腸成纖維細胞中組織纖溶酶原激活受體LRP1介導的。為了在ST數據中證實這一點，研究人員進行了RL空間共表達分析，該分析確定了在空間上對隱窩頂部進行強空間共定位的RL對，例如CEACAM1和CEACAM5（FigureS6Ei）。在成人和胎兒組織中觀察到LRP1與血管外基質的關鍵成分HSPG2配體的顯著共定位(p = 2.17×10^-112和p = 2.37×10^-29（成人）；p = 2.9×10^-19和 p = 0.005（12 PCW) (Figure S6Eii和S6Eiii)。在胎兒ST中，研究人員將S3簇定位于與EC相關的深度和區域（Figure4Hi），將幾種S3特異性基因（如FigureC7）的表達定位于成年組織中與脈管結構相鄰的斑點，因為這些結構比胎兒切片更清晰可見（Figure4Hii）。將胎兒細胞類型標簽轉移到成人ST上，發現S3 HAND1 +和S3 EBF +細胞的成年配對體聚集在大血管周圍(Figure4Hiii–4Hiv)，突顯了這些細胞在形成腸血管支持位支持生態位中發揮的作用，已通過成對細胞類型信號相關性分析證實，其中EC，周細胞和“S3”型成纖維細胞信號在同一ST點內相關（Figure 2Ci）。

理解腸道發育的基本問題是局部形態發生梯度及其拮抗劑是如何塑造腸絨毛形態發生的。研究人員創建了一個涉及8條途徑的基因形態發生圖，用以闡明這些分子在空間和時間上的作用。利用共表達分析確定了11種細胞類型特異性和13種空間共定位的形態發生模塊，在所有ST中對模塊活性進行了評分（Figure5A和S7?A）。這些模塊通常與ST中的組織深度對齊，空間模塊3由來自EC、成纖維細胞和周細胞起源的形態發生子組成，包括LRP1，并且在組織深處（Figure5?Bi）。上皮特異性模塊表達了Hedgehog通路（IHH）的基因，例如在Wnt信號中起重要作用的卷曲的共受體LRP5，并位于管腔附近（Figure5?Bii）。另一個含有肌纖維母細胞成分的細胞，具有形態發生原WNT2B和受體RSPO2，在12PCW時出現彌漫性，并在以后逐漸定位（FigureS7?B）。這與發現成熟的成肌纖維細胞在上皮成分后出現的發現一致，表明ISC-成纖維細胞信號傳導回路直到隱窩形成后才建立。WNT2B由間皮表達，在成肌纖維細胞分化之前提供了配體的唯一來源（FigureS7B）。類似地，RSPO3，其可以用信號通知經由ISC的LGR5（FigureS7Ci）在間皮/肌層模塊中很高，主要在12 PCW之前見到，然后隨著時間的流逝隨著組織深度的增加而消失（Figure5C）。這表明，隨著腸的生長，原本可能因層間物理距離的增加而被打破的形態梯度，可以通過依次發育的細胞類型的表達而恢復。

周圍隱膜S2成纖維細胞或端粒細胞通過表達生長因子β（TGF-β）超家族配體和WNT通路來提供上皮支持。從TGF-β（BMP2，BMP4和BMP5）和非典型WNT通路（WNT5A和WNT5B）（Figure S6 A）。這些S2特異性基因形成了一個主要的粘膜下成纖維細胞形態發生模塊（scRNA-seq模塊2），該模塊包含DLL1，BMP5和NRG1（Figure 5 D）。連同RL相互作用（例如DLL1 – NOTCH2（Figure S7 Cii））一起，這突出顯示了S2細胞及其提供的富含形態原的利基在上皮細胞形成中的重要性。與其他成纖維細胞種群不同，TI和結腸S2細胞不同，有885個差異表達基因（<5％FDR）（FigureS7 D），包括POSTN或TI突出的PDGFRA的結腸特異性表達（Figure S7 D）。在10 PCW之前發現許多位置差異，這表示在隱窩/絨毛形式之前具有很強的位置同一性-例如POSTN和BMP3在它們各自的S2亞型中很早就被發現（Figure 5 E）。S2形態發生譜中的關鍵位置差異提示了一種機制，通過該機制可以發展出極大不同的上皮形態。

最后，研究人員證實S2標記F3在隱窩形成之前就已經存在，并且形成的小丘隨著絨毛的形成而逐漸增加（Figure 5 F）。因此，在人腸道中，S2型纖維母細胞不僅是維持上皮隱窩位所必需的，而且可能在其形成中發揮積極作用。

人類腸道免疫力的發展

該研究中得到的圖譜捕獲了發育過程中來自6個譜系(巨噬細胞，單核細胞，樹突狀細胞，嗜酸性粒細胞，適應性和先天淋巴細胞)的2199個免疫細胞（Firgure6A和6B；Table S1；STAR methods）。免疫細胞在SI中（占捕獲的所有細胞的3％–8％）比結腸（平均占1％– 2.5％）更為普遍，總體而言在孕早期之前尤其罕見。在10 PCW之前，研究人員觀察到了髓樣細胞富集（Figure S8 A），而在12 PCW時，涌入了大量的幼稚CD4⁺和CD8⁺T細胞，自然殺傷細胞（NK），1型先天性淋巴樣細胞（ILC），以及3型ILC（Firgure 6C）。后者在胎兒腸道中的患病率比成人高得多，在某些晚期樣本中占所有捕獲的免疫細胞的30％。

胎兒ILC3表達IL7RA和ID2（TableS1），這對小鼠子宮Peyer’s斑塊（PPs）的形成至關重要，因此將這些細胞區分為3型淋巴組織誘導劑（LTi）。PP的形成是一個LTi細胞、EC和基質細胞之間相互協調作用的過程。此外，鼠類研究顯示其還需要RET/ARTN/GFRA3神經軸，而GFRA3缺乏會導致PP發育受損。腸道相關淋巴樣組織（GALT）的形成被認為在出生前以PPs的形式出現在SI體內，而在出生后以結腸的形式出現。相反，在此，研究人員確定了一個獨特的結腸而不是SI特異的神經膠質種群，它是發育過程中唯一的GFRA3來源，并在15 PCW時擴展（Figure6 D），表明在人類結腸發育過程中可能存在類似的神經免疫回路。

PP形成的其他關鍵介質包括通過CCL19，CCL21和CXCL13促進LTi組織歸巢的基質組織細胞。研究人員發現這些特異性地定位于兩個S4成纖維細胞簇，并且表達隨著發育而增加（Figure6B和6E）。在S4簇中繪制RL相互作用的圖譜突出顯示了與各種免疫細胞的串擾，包括通過VCAM1 – ITGB7的ILC3信號傳遞（FigureS8 B）。這進一步支持了S4在淋巴樣組織形成中的作用-這些粘附分子是GALT形成所必需的。LTi細胞和S4細胞還表現出通過IL7和CCL19/21與它們的受體IL7R/CCR7的相互作用（FigureS8C），如果小鼠中不存在，則會導致無法形成次級淋巴濾泡。

為了在空間上確認這些相互作用，研究人員研究了成人ST，其中粘膜下淋巴濾泡被視為獨特的結構。S4和免疫細胞（例如CD3和CD19）的關鍵標記基因在這些卵泡中和周圍表達，因子分析證實了各種成年免疫細胞（B細胞，T細胞和髓樣細胞）和此處定位的S4細胞類型（Figure6） F）。研究人員還發現ST中關鍵RL對的顯著共定位（包括CCR7 / CC19（1個點內p = 1.098×10 -10，半徑內p = 5.59×10 -49）（Figure6G）。表明S4細胞是成年結腸中與卵泡相鄰的成纖維細胞，在胎兒GALT發育過程中以時間依賴性方式出現。

兩個S4簇在很大程度上都是SI特異的，維持PP的子宮發育，但不維持結腸GALT，并且在12 PCW之前完全不存在（FigureS8 D）。比較這兩個種群的轉錄譜，發現S4 CXCL13 +亞型表現出許多隱性S2成纖維細胞的關鍵特征（POSTN，F3，PDGFRA和BMP5），并且是RANKL/TNFSF11的唯一腸道來源（FigureS8E）-其缺陷導致PP形成受損，并且是PP中M細胞分化所必需的。綜上，PP中相同的隱周成纖維細胞起著上皮隱窩位支持細胞，淋巴組織形成的協調者和間質免疫串擾介體的作用，從而揭示了它們迄今未曾意識到的高度動態的作用。

該研究在時間方面允許研究隨著發育時間而變化的疾病基因（Figure7D），并可以提供與時間相關的信息，突出顯示PCW前12膠質細胞和IM祖細胞表達的基因HMGA2（分別為FDR<2.2e-16）（Figure7Ei），與腸道旋轉不良有關（12q14微缺失綜合癥，ORPHA：94063）。同樣，早期抑制運動神經元特異的NXN的致病變體（Figure7Eii）會導致卵泡擴張（Robinow綜合征，OMIM：618529）。在此發育時期，腸子回到了腹部，表明ENS細胞和肌肉祖細胞可能對該過程至關重要。

總結