中文題目：5-ASA的腸道微生物代謝降低了其在炎癥性腸病中的臨床療效

發表期刊：nature medicine

發表時間：2023

影響因子：82.9

研究背景

炎性腸病 (IBD)是一種慢性、使人虛弱的胃腸疾病，治療失敗率較高。目前尚無系統的方法預測對IBD療法的反應。抗炎藥物美沙拉嗪，也被稱為5-氨基水楊酸 (5-ASA)，是IBD最常用的處方療法之一，通常在結腸內發揮作用；然而，隨著時間的推移，超過一半的IBD患者對5-ASA沒有反應或最終失去反應。因此，有必要確定并消除此類治療失敗的原因。

研究思路

研究重點

1、來自IBD患者的多組學研究確定了5-ASA的使用

利用人類微生物組項目炎癥性腸病多組學數據庫（IBDMDB，http://ibdmdb.org），對79名克羅恩病（CD）或潰瘍性結腸炎（UC）患者的糞便樣本進行多組學分析，共鑒定了1036個宏基因組（MGX）、440個元轉錄本（MTX）和508個非靶向代謝組（MBX），以及283個MBX-MGX對和213個MGX-MTX對。隨后針對13名新使用5-ASA的患者來確定5-ASA在體內直接調節的特定糞便代謝物，結果發現5-ASA使用前后中的5-ASA和N-乙酰5-ASA水平呈顯著差異，且經5-ASA治療后，賴氨酸合成途徑中的細菌代謝產物—2-氨基己二酸的含量減少，煙酸代謝也發生了顯著變化。

進一步評估微生物、宿主和其他因素對這些差異顯著的代謝物的相對貢獻，最終發現5-ASA的藥物水平在確定5-ASA調節代謝物水平方面具有最大的預測能力（35%），其次是微生物組特征（15%）和其他宿主因素（7%）。隨后，通過另一個獨立的IBD患者隊列中鑒定并驗證了兩種可能的5-ASA衍生物—N-丙酰基5-ASA和N-丁酰基5-ASA，它們的變化可以部分地由腸道微生物組來解釋。

圖1?5-ASA可直接影響糞便代謝組，并通過微生物組進行生物轉化

2、5-ASA代謝腸道微生物酶的鑒定

接下來確定參與5-ASA生物轉化的腸道微生物酶。首先對服用及未服用5-ASA的患者微生物進行轉錄組分析，最終鑒定了兩個顯著過表達的具有推定乙酰轉移酶功能的UniRef90基因簇：GNAT家族NAT（UniRef90 ID: C7H1G6）和乙酰輔酶a乙酰轉移酶（UniRef90 ID: R6TIX3），以及四個具有乙酰輔酶a乙酰轉移酶結構域的候選基因（IDs: R6CZ24, R5CY66, T5S060和A0A1C6JPG6）。隨后將糞便樣本分為N-乙酰5-ASA高水平和N-乙酰5-ASA低/陰性水平兩組，計算與N-乙酰5-ASA相關的每個元轉錄組基因簇的敏感性和特異性，結果發現了另外7個假定的乙酰轉移酶基因簇與使用者的N-乙酰5-ASA水平呈正相關。最終得到的12個之前未被表征的候選乙酰轉移酶可分為硫解酶和酰基輔酶A N-酰基轉移酶兩組，其中酰基輔酶A NAT家族比硫解酶家族表現出更大的序列異質性，且酰基輔酶A NAT酶幾乎都來自擬桿菌門，而硫解酶來自厚壁菌門。通過研究菌株水平的基因組，同樣發現了一部分普氏鐮孢菌株編碼相關的乙酰轉移酶。

圖2N-乙酰5-ASA微生物酶包括硫代酶和酰基輔酶A N-乙酰轉移酶

3、5-ASA失活酶生化特性的推定

為了推測硫解酶和酰基輔酶A NAT超家族具有潛在的5-ASA滅活能力，選用來自厚壁菌門的候選硫解酶CAG:176（UniRef90 ID: R6CZ24）和來自福氏假單胞菌的酰基輔酶A NAT（UniRef90 ID:C7H1G6）用于進一步的生化表征。用已知的腸道鏈球菌酶作為陽性對照，對乙酰化5-ASA采用體外質譜分析，最終證實了厚壁菌CAG:176硫解酶和F. prausnitzii酰基輔酶A NAT具有使用乙酰輔酶A乙酰化5-ASA的能力。

隨后測試了硫解酶對其他含胺基異生素（包括5-ASA異構體4-ASA、異煙肼、普魯卡因胺和肼屈嗪）的乙酰化活性，結果并未發現這些化合物的任何乙酰化，這表明了硫解酶的底物選擇性。此外，編碼第二個預測的硫解酶基因（R6TIX3）的Oscillibacter sp菌株KLE 1745的活培養物也能夠將5-ASA乙酰化為N-乙酰基5-ASA。

為了深入了解厚壁菌CAG:176硫解酶（FcTHL）如何乙酰化5-ASA，將FcTHL的乙酰化未配體晶體結構疊加在乙酰化硫解酶晶體結構上，與來自充分表征的革蘭氏陰性分枝菌（ZrTHL）的乙酰輔酶A復合。隨后將FcTHL與NAT (PDB ID: 2PFR)的晶體結構進行比對，進一步探究厚壁菌CAG:176硫解酶的推定活性位點是否類似于腸道鏈球菌NAT的活性位點，最終揭示了活性位點區域中的半胱氨酸和組氨酸三聯體。

圖3?5-ASA在體外的乙酰化活性的證實

4、IBD治療失敗與5-ASA代謝酶的宏基因組攜帶有關

基于臨床服用5-ASA的個體差異性，接下來檢查12種乙酰轉移酶的存在是否與5-ASA治療失敗有關。收集39名在任何時間點接受5-ASA治療及使用類固醇患者的609份糞便樣本，使用多變量邏輯回歸模型，調整與疾病風險相關了因素-年齡、性別、吸煙狀況和IBD亞型，納入每個參與者的NAT2表型來解釋宿主遺傳，最終發現糞便樣本中存在4種乙酰轉移酶基因與類固醇起始風險增加顯著相關。4種乙酰轉移酶基因有三種來自硫解酶超家族，一種來自酰基輔酶A超家族。且較早的發病年齡和CD與UC狀態相比，同樣與開始使用類固醇的更高風險顯著相關。但未發現類固醇使用風險和大腸桿菌NAT的宏基因組存在聯系。

在敏感性分析中，微生物乙酰轉移酶基因數量的增加與類固醇起始風險的增加顯著相關；從未使用過5-ASA治療的患者基因家族與類固醇的使用沒有正相關。隨后使用混合效應模型對參與者進行調整，發現存在三個或更多乙酰轉移酶基因也與類固醇使用風險增加相關，這在隨后在未使用類固醇的208名5-ASA使用者隊列中得到了驗證。

圖4腸道微生物5-ASA滅活乙酰轉移酶與5-ASA使用者治療失敗的更大風險相關

研究總結

本研究結果首次提供了特異性腸道代謝酶與IBD 5-ASA治療失敗之間的直接聯系，從而產生了直接的臨床潛力。5-ASA是UC最常用的處方藥。為了保持有效，它必須以未修飾的形式存在于結腸腔中，因此，與其他藥物不同，它在小腸中的吸收很差。5-ASA治療失敗的個體通常進展為風險更高的免疫抑制治療，而只有在必要時 (即腸道微生物組中存在修飾5-ASA的硫解酶序列)才有能力這樣做，這將為精準醫學提供有價值的生物標志物。此外，闡明微生物失活5-ASA的酶學機制可能有助于未來研發微生物特異性酶抑制劑，以增強5-ASA的療效。在本研究中，我們的數據是觀察性的；需要更多的介入研究來加強我們的發現，無論是通過在IBD患者中的臨床試驗還是通過單定植小鼠。目前，這些發現為IBD的個性化微生物醫學打開了一扇概念之窗。

發表時間：2024年12月

合作單位：農業農村部農業環境保護研究所

發表期刊：Journal of Hazardous Materials（IF 8.9）

研究背景

塑料污染現狀嚴峻且向納米級轉化：塑料已成為現代生活不可或缺的材料，但大量塑料廢棄物造成了全球緊迫的環境問題，在水、海洋生物、人類排泄物甚至極地沉積物等多種介質中均有檢出。環境風化作用使塑料碎片逐漸分解為微塑料（<5μm）和納米塑料（<1μm），其中納米塑料（NPLs）因更豐富、反應性更強，能到達更偏遠區域并穿透活細胞，環境風險遠高于微塑料。納米塑料與抗生素抗性基因（ARGs）的關聯研究不足：已有研究表明塑料可促進 ARGs 增殖，且納米材料（如金屬納米顆粒 AgNPs、ZnO NPs）與細菌抗生素抗性進化相關，但關于納米塑料對細菌抗生素抗性的影響尚不明確。金屬納米顆粒與納米塑料在物理化學性質和界面活性上存在本質差異，且雖有研究指出微塑料可吸附 ARGs 加速其傳播，但納米塑料與耐藥菌共存狀態及作用機制的研究仍較零散。

粘質沙雷氏菌的研究價值：粘質沙雷氏菌在自然環境中分布廣泛，可定殖于水和土壤介質，是醫院獲得性感染的重要條件致病菌，能引發肺炎、尿路感染和敗血癥等疾病，且其自身攜帶 ARGs。隨著廣譜抗生素的大量使用，該菌的耐藥性增強，對臨床治療構成挑戰，因此研究納米塑料脅迫下其抗生素抗性軌跡具有重要意義。

測序策略

轉錄組測序（RNA-seq）+基因組測序

研究結論

1、納米塑料可促進粘質沙雷氏菌抗生素抗性進化，且作用受粒徑影響：

暴露于納米塑料后，粘質沙雷氏菌對磺胺甲噁唑（SMX）、諾氟沙星（NOR）、鏈霉素（STR）、卡那霉素（KA）等抗生素的抑菌圈逐漸縮小，ARGs 相對豐度顯著高于無納米塑料組（CK），且呈現 “200nm 納米塑料組（T2）>600nm 納米塑料組（T1）>CK” 的規律（T2、T1、CK 的 ARGs 相對豐度中位數分別為 0.82%、0.62%、0.56%）。

隨著傳代，CK 和 T1 組的 ARGs 豐度呈下降趨勢（歸因于基因適應性成本），但 T1 組下降幅度小于 CK 組，而 T2 組 ARGs 豐度呈上升趨勢，表明小粒徑納米塑料對細菌抗生素抗性進化的促進作用更顯著。

2、不同粒徑納米塑料促進抗性進化的機制存在差異：

600nm 納米塑料：主要通過影響細菌細胞膜通透性促進抗性。轉錄組分析顯示，其誘導的差異表達基因（DEGs）多與物質運輸和細胞膜功能相關，如 LysE 家族轉運蛋白、ABC 轉運蛋白通透酶等表達上調，增強抗生素外排能力，進而提升細菌抗性。

200nm 納米塑料：主要通過調控細菌代謝過程增強抗性。其誘導的 DEGs 多參與氧化還原過程、羧酸代謝過程等，如硫胺素焦磷酸結合蛋白（TPP）下調導致細菌代謝受損，激活抗性相關基因表達；環氧奎奴基還原酶 QueH 上調提高細菌蛋白質合成效率，促進外排泵等抗性相關蛋白合成。同時，200nm 納米塑料對細菌生長抑制更強，使細菌進入低代謝休眠狀態，抵抗抗生素攻擊。

3、納米塑料通過誘導基因突變增強細菌抗性：

納米塑料暴露會導致粘質沙雷氏菌發生單核苷酸多態性（SNP）突變，且粒徑越小突變概率越高（T2 組 SNP 純合子數量 31513 個，T1 組 31380 個）。突變基因功能主要涉及催化活性、結合、細胞膜、細胞過程和代謝過程，部分突變基因（如 HMI62_RS24365）可改變細胞膜功能，增強抗生素外排，進而提升抗性。

4、納米塑料可加速 ARGs 水平轉移，小粒徑作用更突出：

納米塑料暴露顯著提高粘質沙雷氏菌的接合轉移頻率（T2 組 22.98%、T1 組 8.13%、CK 組 7.35%）和游離質粒轉化能力（T2 組轉化頻率是 CK 組的 6 倍，T1 組是 CK 組的 2 倍），且轉移的質粒攜帶多種抗性基因和外排泵基因。

分子對接顯示，納米塑料可與細菌細胞膜蛋白（如 5NUQ，結合能 – 8.54kcal/mol）結合，像 “牽引器” 一樣促進細菌間接觸；同時，納米塑料能增強細菌運動能力（T2 組細菌擴散圈最大），進一步提高 ARGs 水平轉移頻率。

結果展示

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01 土壤生態密碼解鎖

研究熱點：元素循環 | 污染修復 | 植物-微生物互作

研究樣本類型：

① 土壤：農田、森林、沙漠、凍土、鹽堿地、草地、濕地等不同生態類型的土壤；

② 泥：污泥、混凝土、礦地、泥炭地、生活垃圾；

③ 沉積物：湖泊、近海、海洋底泥。

核心方向：

① 元素循環：微生物驅動的碳氮循環（如甲烷氧化菌、硝化菌）；

② 污染修復：污染物（重金屬、農藥）的微生物降解機制；

③ 植物微生物互作：植物根際促生菌（PGPR菌群）與土壤健康研究。

?創新前處理方案：

① 針對含水量較多的樣本（如濕地等，如圖1.1）采用高速離心脫水技術：為了富集微生物，取完樣本后高速離心去除濕地中的水分，避免導致后續提取得到的核酸量偏少不足下游PCR反應；

② 針對于礦地等礦物元素以及重金屬含量豐富的土壤（見圖1.2）采用PBS富集+重金屬去除：①介于重金屬脅迫下微生物豐度可能降低，為了獲取更多微生物，前處理會用無菌PBS buffer對微生物進行富集處理。②重金屬（如As、Cd、Pb）可能結合核酸或抑制酶活性，為了避免重金屬殘留對后續PCR反應的抑制作用，前處理初步除重金屬等雜質；

③ 針對于微生物含量較低的砂土（見圖1.3）采用低微生物量增強富集方案：砂土中的微生物含量相對較低，正常的樣本取樣量提取后的核酸濃度極低，很難滿足下游反應。為了解決這一問題，前處理會用無菌PBS buffer對更多組織樣本進行組織涮洗，富集微生物；

④ 針對于腐殖質含量較高的土壤（如黑土等，見圖1.4）采用腐殖質深度清除工藝：為了減少腐殖質對提取后核酸的下游反應的抑制作用，在提取過程中增加除雜劑以達到充分去除腐殖質的效果。

02 水體微生物組

研究熱點：元素循環 | 重金屬污染修復

研究樣本類型：

① 自然水體：海洋/河流/湖泊/地下水/冰川水；

② 人工水體：污水處理廠/養殖池

核心方向：

① 元素循環：農田徑流對水質的影響。

② 污染修復：重金屬的微生物降解機制；

?創新前處理方案：

① 濾膜樣本：碎片化裂解+二次過濾建議（圖2.1）：將濾膜（使用0.22 μm或0.45 μm濾膜過濾大體積水樣）剪碎后放入裂解緩沖液。（若濾膜很干凈，說明微生物含量很低，建議繼續過濾更大體積水樣至濾膜表面有明顯痕跡。）

② 液態樣本：離心富集法（圖2.2、2.3）：若樣本較澄清，為了富集更多微生物，取2ml-50mL液體樣本離心富集收集微生物沉淀。若樣本較渾濁，則正常取樣。

03 腸道微生態探秘

研究熱點：中藥治療?|?代謝疾病?|?腸X軸?|?免疫疾病

研究樣本類型：

①家畜（牛、豬）腸道微生物、糞便堆肥；

②魚類、昆蟲、哺乳動物腸道、糞便微生物。

核心方向：

① 中藥治療：中草藥與腸道微生物組成密切相關。

② 代謝疾病：微生物對宿主代謝（肥胖、糖尿病等）的影響。

③ 腸X軸：八大腸X軸，如腸-腦軸（Gut-Brain Axis）與神經退行性疾病（如阿爾茨海默病）的關聯。

④ 免疫疾病：腸道微生物與宿主免疫系統的交互（如調節T細胞分化）。

?創新前處理方案：

① 腸道樣本（圖3.1、3.2）：采用粘膜剝離+多級除雜技術：為了初步去除宿主以及大分子雜質，前期會將腸道的內容物從腸道黏膜中釋放，充分獲取微生物并進行初步除雜。

② 硬質糞便：強化研磨破壁工藝：相較于圖3.4的小鼠糞便來說，圖3.3的小鼠糞便使用普通的研磨珠無法打碎從而導致提取后的核酸含量較低，為了使微生物充分釋放，提取時會進行充分研磨獲取糞便微生物。

經驗分享：

百邁客生物近年來承接的樣本包含且不局限于上文所述的各種組織類型。利用目前現有成熟的提取技術，針對不同組織類型采用最精準的提取方法，使得微生物樣本合格率可以達到97%以上，其中擴增子二代樣本合格率可以高達99%以上。