1.1適用范圍
本指南介紹百邁客平臺單細(xì)胞產(chǎn)品的送樣要求及制備方法，采集送樣前請詳細(xì)閱讀。
1.2聲明
我國法定的傳染病分為三大類：甲類（一類）傳染病包括霍亂和鼠疫；乙類（二類）傳染病包括傳染性非典肺炎、新型冠狀病毒 (2019-nCoV)肺炎、艾滋病、病毒性肝炎、人感染高致病性禽流感、脊髓灰質(zhì)炎、麻疹、流行性出血熱、狂犬病、登革熱、流行性乙型肝炎、細(xì)菌性和阿米巴性痢疾、肺結(jié)核、傷寒和副傷寒、炭疽、流行性腦脊髓膜炎、白喉、百日咳、新生兒破傷風(fēng)、猩紅熱、布魯士病、梅毒、淋病、鉤端螺旋體病、血吸蟲、瘧疾。丙類（三類）傳染病包括流行性感冒、流行性腮腺炎、流行性和地方性斑疹、傷寒、風(fēng)疹、麻風(fēng)病、急性出血性結(jié)膜炎、黑熱病、絲蟲病、包蟲病、還有除了霍亂、細(xì)菌、阿米巴性痢疾、傷寒和副傷寒以外的感染性腹瀉。
涉及上述傳染病的科學(xué)研究需符合國家的相關(guān)規(guī)定，為嚴(yán)格遵守國家法律法規(guī)，本著對社會及相關(guān)操作人員負(fù)責(zé)的態(tài)度，我司要求客戶方真實準(zhǔn)確地提供樣品的生物安全性信息，對樣品是否含有上述感染性病原體進行事先說明。樣品中含有上述感染性病原體時，客戶方需要提供符合生物安全等級要求的實驗室以便開展相關(guān)實驗，實驗進行時，客戶方有義務(wù)協(xié)助我方實驗員做好實驗安全防護。客戶方不得隱瞞樣品的生物安全性信息，若出現(xiàn)樣品含有感染性病原體而客戶事先未告知我司的情況，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)我司將停止進行相關(guān)項目，已產(chǎn)生的費用由客戶方承擔(dān)。如因客戶方提供的生物安全性信息不實、隱瞞樣品感染性等有關(guān)情況等造成實驗員及相關(guān)人員被感染、疾病傳播等嚴(yán)重后果的，我司將按規(guī)定報告國家相關(guān)部門，并將通過法律等手段追究相關(guān)責(zé)任。
2.1送樣量要求
目前百邁客單細(xì)胞產(chǎn)品包含：單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組、單細(xì)胞免疫組庫、單細(xì)胞ATAC，不同類型單細(xì)胞產(chǎn)品具體送樣量要求如下表：
| 產(chǎn)品 | 樣本類型 | 樣本量要求 |
| 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、單細(xì)胞免疫組庫 | 常規(guī)新鮮組織 | ≥200mg |
| 脊髓、皮質(zhì)、腦膠質(zhì)瘤 | ≥300mg | |
| 關(guān)節(jié)滑膜 | ≥400mg | |
| 冠狀動脈、主動脈、椎間盤、脂肪、軟骨、硬骨、坐骨神經(jīng) | ≥500mg | |
| 穿刺樣本 | ≥3條 | |
| 外周血 | ≥3mL | |
| 腦脊液 | ≥10mL | |
| 腹水 | 5-10mL | |
| 肺泡灌洗液 | ≥50mL | |
| 流式分選細(xì)胞 | ≥5*105個 | |
| 原代/培養(yǎng)/凍存細(xì)胞 | ≥1*106個 | |
| 單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組、單細(xì)胞ATAC | 組織 | ≥150mg（RNA提取另算） |
| 穿刺樣本 | ≥3條（長度大于1 cm） | |
| 外周血 | ≥3mL | |
| 流式分選細(xì)胞 | ≥5*105個 | |
| 原代/培養(yǎng)/凍存細(xì)胞 | ≥1*106個 |
2.2樣本質(zhì)量要求
| 產(chǎn)品名稱 | 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn) |
| ?
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組 單細(xì)胞免疫組庫 |
?
細(xì)胞總數(shù)：＞5×105個； 活性：> 85%； 直徑：<40μm； 體積：> 100μl； 濃度：700~1200 cell/μl； 結(jié)團率：<15%； 不含Ca2+、Mg2+ |
| ?
單細(xì)胞ATAC 單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組 |
?
細(xì)胞總數(shù)：＞5×105個（最少為1×105個）； 細(xì)胞活性：＜5%； 體積：> 100μl； 濃度：700~1200 nucleus/μl； 結(jié)團率：<10%； 核膜完整性：將細(xì)胞核分為 ABCD級，要求A級細(xì)胞核>80% |
3.1動物單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組/單細(xì)胞免疫組庫
3.1.1 新鮮動物組織樣本
1）采集前準(zhǔn)備：
實驗前分別提前24小時4℃預(yù)冷4個冰袋，-20℃預(yù)冷2個冰袋。
2）組織處理：
A.新鮮組織從活體取下，要求組織量至少為200mg（黃豆粒大小）；
B.去除周圍的脂肪、結(jié)締組織或者壞死組織，用預(yù)冷的無菌PBS或者生理鹽水清洗2遍，清洗掉血水等雜質(zhì)；
C.將清洗干凈的目標(biāo)組織樣本切割成5cm-1cm左右的組織塊，盡量不超過1cm，保證組織塊能夠充分接觸組織保存液，完全浸沒在組織保存液中，快速轉(zhuǎn)移到解離實驗室進行單細(xì)胞懸液制備，或者寄送到百邁客實驗室進行解離。
3）樣本寄送與運輸：
A.離心管用Parafilm 封口膜密封好，在每個樣品管上清晰、簡明地標(biāo)記樣品名稱（采用質(zhì)量較好的油性筆，并避免與乙醇等有機溶劑接觸），樣品名稱請避免出現(xiàn)漢字，采用字母和數(shù)字表示，長度控制在8個字符以內(nèi)；
B.樣本管用氣泡膜或紗布包裹，避免樣品管直接接觸冰袋而導(dǎo)致組織冰凍而壞死，請根據(jù)運輸時間確認(rèn)冰袋的數(shù)量，確保樣本運輸?shù)竭_(dá)目的地時，樣本溫度保持在2-8℃。
4）注意事項：
A.取樣時用無菌手術(shù)刀或剪刀進行取樣，如必須用電刀取樣請避免電刀灼燒部位，取樣避免壞死部位，取樣不能有血凝塊；
B.公司承接樣本及樣本注意事項詳情請見”單細(xì)胞（核）物種組織白名單”。
C.采樣前可以提前聯(lián)系百邁客當(dāng)?shù)劁N售經(jīng)理獲取組織保護液，由百邁客實驗室寄送分裝好的組織保存液（美天旎，貨號130-100-008），組織保護液在2-8℃保存，不建議過多囤放以防滋生細(xì)菌，使用前觀察試劑狀態(tài)是否為無色透明液體，無沉淀、無異樣；
D.組織在組織保護液中的最佳儲存時間為48h，可維持組織樣本的細(xì)胞活性及完整細(xì)胞表位，具體操作方法可參考《百邁客組織保存液寄樣指南》視頻，可以聯(lián)系百邁客當(dāng)?shù)劁N售經(jīng)理獲取。
送樣不規(guī)范示例：
A.樣本沒有紗布包裹，與冰袋直接接觸，導(dǎo)致樣本結(jié)冰，解離活率不足；
B.組織太多，占滿整個管子，組織與保護液接觸面積很少，使保護液無法有效的保持組織活性；
C.樣本結(jié)冰，組織被完全凍住，解離活率很低；
D.未將管口包裹住，樣本運輸過程中管口打開，保護液和部分組織灑落在管外。
3.1.2 血液樣本
1）樣本采集：
A.采集新鮮外周血至少3mL，迅速置于EDTA抗凝管（紫色）中保存，取樣完成后需要立即輕柔管上下顛倒采血管4-6次，保證EDTA抗凝效果；
B.4℃、24h內(nèi)轉(zhuǎn)移到實驗室，分離PBMC后進行后續(xù)實驗；
C.或者利用淋巴細(xì)胞分離液分選出外周血單核細(xì)胞PBMC（分選步驟可參考第3.2部分），加入細(xì)胞凍存液梯度凍存，具體操作見第3.1.3部分（推薦上門服務(wù)）；
2）樣本寄送與運輸：
A.離心管用Parafilm 封口膜密封好，在每個樣品管上清晰、簡明地標(biāo)記樣品名稱（采用質(zhì)量較好的油性筆，并避免與乙醇等有機溶劑接觸），樣品名稱請避免出現(xiàn)漢字，采用字母和數(shù)字表示，長度控制在8個字符以內(nèi)；
B.樣本管用氣泡膜包裹，避免樣品管直接接觸冰袋而導(dǎo)致組織冰凍而壞死，請根據(jù)運輸時間確認(rèn)冰袋的數(shù)量，確保樣本運輸?shù)竭_(dá)目的地時，樣本溫度保持在2-8℃。
3）注意事項：
A.取樣前需要確認(rèn)EDTA抗凝管在保質(zhì)期范圍內(nèi)，只能用EDTA紫色抗凝管；
B.百邁客可以提供PBMC分離服務(wù)；
C.血液離體時間不超過24h。
3.1.3 PBMC/細(xì)胞懸液樣本
PBMC樣本與細(xì)胞懸液樣本，如果沒有預(yù)約上門服務(wù)，需要按細(xì)胞梯度凍存的方式凍存起來，干冰寄送，細(xì)胞梯度凍存操作步驟如下：
A.凍存前準(zhǔn)備：提前30min從-80℃冰箱取出梯度降溫盒并恢復(fù)至室溫備用；
B.準(zhǔn)備好900μL血清+100μL DMSO的細(xì)胞凍存液；
C.收集PBMC或細(xì)胞，用預(yù)冷的無菌PBS清洗1-2遍，將配好的凍存液進行細(xì)胞重懸；
D.將重懸好的細(xì)胞懸液分裝到細(xì)胞凍存管中，并在凍存管側(cè)壁做好標(biāo)記；
E.將凍存管放入梯度降溫盒中，放入-80℃冰箱，凍存的細(xì)胞在梯度降溫盒中放置24h后可取出放置在液氮保存，或者直接放置在干冰上進行冷凍運輸，寄送到百邁客實驗室。
3.1.4 穿刺樣本
1）樣本采集：對于穿刺樣本，在采集樣本過程中，使用粗針(穿刺針管外徑≥1.2mm)穿刺采集3條樣本。
2）注意事項：
A.組織處理、樣本寄送與運輸參考第1.1部分；
B.采集時需注意的是不能用真空針采樣；
C.穿刺樣品量較少，建議送樣量≥3條，通過增加穿刺樣本數(shù)可以提高成功率。
3.2 動物單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組/單細(xì)胞ATAC
3.2.1 冷凍組織樣品
1）樣本采集與寄送：
A.新鮮組織從活體取下，要求組織量至少為250mg；
B.去除周圍的脂肪、結(jié)締組織或者壞死組織，用預(yù)冷的無菌PBS或者生理鹽水清洗2遍，清洗掉血水等雜質(zhì)，并用紗布或無塵紙擦干組織表面水分；
C.將清洗干凈的目標(biāo)組織樣本切割成5cm-1cm左右的組織塊，盡量不超過1cm，組織分成兩份，一份150mg，一份100mg并做區(qū)分標(biāo)記，分別轉(zhuǎn)入兩個凍存管中，150mg提取細(xì)胞核，100mg提取質(zhì)檢RNA（要求 RIN≥6.0）；
D.立即液氮速凍30min以上，再轉(zhuǎn)移到-80℃保存或干冰寄送，確保組織寄送到實驗室后為冷凍狀態(tài)。
2）注意事項：
心臟、肌肉、皮膚、肺癌、子宮、病變纖維化和器官硬化類組織，提核后會產(chǎn)生較多的碎片，需要進行流式分選去碎片；如果涉及到以上樣本，請送樣前提前告知，以便開始提核實驗前預(yù)約好流式細(xì)胞儀，以免耽誤實驗進度。
3.2.2 凍存細(xì)胞樣本
1）凍存前細(xì)胞質(zhì)檢：凍存前對細(xì)胞質(zhì)量進行檢測，要求細(xì)胞活性大于90%、細(xì)胞結(jié)團率小于 10%，樣品無細(xì)胞碎片等雜質(zhì)；原代細(xì)胞或培養(yǎng)細(xì)胞總數(shù)大于1×106個，流式分選細(xì)胞大于5×105個，并提供質(zhì)檢結(jié)果。
2）細(xì)胞梯度凍存：
A.凍存前準(zhǔn)備：提前30min從-80℃冰箱取出梯度降溫盒并恢復(fù)至室溫備用；
B.準(zhǔn)備好900μL血清+100μL DMSO的細(xì)胞凍存液；
C.收集PBMC或細(xì)胞，用預(yù)冷的無菌PBS清洗1-2遍，將配好的凍存液進行細(xì)胞重懸；
D.將重懸好的細(xì)胞懸液分裝到細(xì)胞凍存管中，并在凍存管側(cè)壁做好標(biāo)記；
E.將凍存管放入梯度降溫盒中，放入-80℃冰箱，凍存的細(xì)胞在梯度降溫盒中放置24h后可取出放置在液氮保存，或者直接放置在干冰上進行冷凍運輸，寄送到百邁客實驗室。
3.2.3 其他類
血液樣本參考第3.1.2部分，PBMC/細(xì)胞懸液樣本參考第3.1.3部分，推薦直接上門服務(wù)。
3.3?植物單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組
3.3.1?新鮮植物組織樣品
1）活體植株（優(yōu)先推薦）
A.幼嫩植株：種子培育的低齡幼苗（7-14 天）、組培苗——葉片、幼嫩莖、莖尖、根尖；
B.成熟植株：莖尖組織及靠近莖尖的第 1-2片幼嫩葉片、發(fā)育中的花或者花序；
C.取樣量：保證每一個單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組文庫的理論用量 0.5-2g；
D.其它：特殊貴重活體樣品需要客戶提供樣品的種植、保存條件（溫度、光照、營養(yǎng)液、澆水條件、PH 等等），以保證樣品的正常生長；
E.每一個根部保留少量土壤，利用錫箔紙或者塑料薄膜將植株根部包裹起來， 植株部分需要利用小鐵環(huán)或者絲帶纏繞，保證枝條莖葉不分散，但不需要捆綁非常緊實，防止機械對莖枝葉的損傷。
F.外面用紙箱或者泡沫包裹，防止植株碰撞，并用塑料薄膜纏繞固定。
G.一般活體植株常溫運輸培養(yǎng)，如果有特殊培養(yǎng)條件（需要做相應(yīng)的處理，例如，低溫用冰袋運輸，冰袋與密封袋之間放置泡沫板）。
2）離體枝條
A.枝條選擇：枝條頂端有待萌發(fā)葉芽，且葉芽周邊有幾片幼葉；枝條中下端保留部分成熟葉片；
B.枝條預(yù)處理：剪斷枝條，自底端往上約5cm 用浸透水的吸水紙包裹好，放入自封袋，袋中噴水，填充部分空氣，密封袋口；
C.枝條運輸：自封袋放入泡沫箱，箱體內(nèi)側(cè)壁放部分冰袋（保證低溫運輸），冰袋與自封袋間放置泡沫板，防止冰袋積壓樣品或因冰袋與樣品直接接觸導(dǎo)致樣品被凍傷；
D.運輸時間：保證24 h內(nèi)到樣，最多不得超過48 h；
E.取樣量：保證每一個單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組文庫的理論用量 0.5-2g；
F.其它：取“離體枝條”僅限比較難以獲得幼嫩活體植株的項目，如野外采樣、植株過大等導(dǎo)致的取樣或運輸比較困難的項目；離體枝條到樣后如有損傷等將不再用于實驗；離體枝條如果保存、運輸不善會存在部分潛在風(fēng)險：即得到的實驗效果可能會比活體植株檢測結(jié)果稍差（理論上的潛在風(fēng)險）。
3）注意事項
A.建議一次送樣量≥2g；
B.所有待取的幼嫩組織長勢必須正常（無病蟲害、無營養(yǎng)缺失）；
C.對于需要保留莖尖的特殊情況，取樣時不取莖尖組織，只取緊靠近莖尖的第 1-2 片嫩葉；
D.部分植物單細(xì)胞核項目（物種及組織類型在我司白名單之外）在正式啟動前會進行預(yù)實驗以判斷能否順利開展正式實驗，故活體樣本送樣時應(yīng)保證至少3天的啟動延時（即活體樣本到樣后需等待3天至預(yù)實驗合格后方能正式啟動樣本，如對時期要求嚴(yán)格的樣本需格外注意），送樣前可與我司溝通確認(rèn)具體情況。
白菜植株
打包后的白菜植株
3.3.2?冷凍組織樣品
1）樣本采集與寄送：
A.新鮮組織從活體取下，要求組織量至少為700 mg；
B.去除周圍的非目標(biāo)組織，用預(yù)冷的無菌PBS或者生理鹽水清洗2遍，清洗掉雜質(zhì)；
C.將清洗干凈的目標(biāo)組織樣本切割成0.5cm-1cm左右的組織塊，盡量不超過1cm，剪切成約0.5 cm,不足0.5 cm的從中間切開即可；
D.將組織分成兩份，一份600mg，一份100mg并做區(qū)分標(biāo)記，其中600 mg用來提取細(xì)胞核，100 mg用來提取 RNA（要求 RIN≥7.0）；
E.立即液氮速凍30min以上，再轉(zhuǎn)移到-80℃保存或干冰寄送，確保組織寄送到實驗室后為冷凍狀態(tài)。
圖1 百邁客單細(xì)胞測序服務(wù)流程
4.1 懸液制備方案評估
由于不同物種和組織類型的解離條件差異較大，百邁客提供單細(xì)胞懸液制備預(yù)實驗服務(wù)，會對目標(biāo)組織類型的單細(xì)胞懸液制備方案進行評估。提前預(yù)約好樣本寄送時間，保證到樣后盡快開展單細(xì)胞懸液制備實驗，組織凍存液寄送樣本最好在48h內(nèi)完成解離；確定好細(xì)胞懸液制備方案后，即可正式開展項目。
4.2 正式實驗
目前百邁客提供兩種類型的正式實驗服務(wù)模式：
4.2.1 上門服務(wù)
老師只需提供組織樣本，預(yù)約上門后實驗工程師上門，按照預(yù)實驗評估的解離方案進行解離、單細(xì)胞分選上機、反轉(zhuǎn)錄成cDNA后低溫暫存，后續(xù)在百邁客實驗室完成建庫測序。
或者老師完成單細(xì)胞懸液制備實驗，實驗工程師進行單細(xì)胞懸液質(zhì)量評估，評估合格后進行后續(xù)實驗操作，單細(xì)胞質(zhì)量要求見第2.2部分。
備注：單細(xì)胞懸液制備好后，建議在30分鐘內(nèi)質(zhì)檢上機，建議老師提前安排好時間；儀器設(shè)備要求詳情見第4.3.3部分。
4.2.2 組織寄送
百邁客單細(xì)胞組織保存液寄送方式（推薦），采用組織保存液儲存組織樣本，既可以保持樣本最原始組織活性狀態(tài)，又可以解決樣本難以獲取以及批次性效應(yīng)等問題，老師寄送組織到百邁客實驗室，實驗工程師進行解離、單細(xì)胞分選上機、反轉(zhuǎn)錄、建庫、測序。
注意事項
- 根據(jù)組織類型選擇服務(wù)模式：適用于組織保存液寄送的組織推薦組織，寄送，其他不適用寄送的組織類型、細(xì)胞、血液樣本推薦上門服務(wù)；
- 一些特殊樣本由于組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞大小等限制，在不適用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序的情況下，可以進行單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組測序。
| 細(xì)胞類型 | 說明 |
| 神經(jīng)元細(xì)胞 | 4~120μm,常見星形、錐體形、梨形和圓球形狀，長突起細(xì)胞 |
| 巨噬細(xì)胞 | ~50μm, 多突起的星形細(xì)胞 |
| 皮下脂肪細(xì)胞 | 60~120μm，粒徑過大 |
| 心肌細(xì)胞 | 3~100μm，類型復(fù)雜非規(guī)則球形，移行細(xì)胞細(xì)長型，特別心肌腫大時細(xì)胞粒徑會達(dá)100μm |
| 腎臟細(xì)胞 | 系膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞（足細(xì)胞）、腎小管上皮細(xì)胞，類型復(fù)雜，足細(xì)胞豐度低 |
| 骨骼肌纖維 | 長柱形的多核細(xì)胞，長1~40mm，直徑10~100μm |
| 卵細(xì)胞 | >0.1mm，成熟卵泡直徑18-25mm |
4.2.3 儀器耗材清單
| 設(shè)備及描述 | 儀器要求 | 用途 |
| 冰箱 | -80℃、-20℃ | 暫存試劑 |
| 4℃水平離心機* | 支持1.5ml/15ml離心管 | 解離液分離；細(xì)胞收集 |
| 制冰機和冰盒 | — | 解離中提供低溫環(huán)境 |
| PCR儀* | 支持100 μL反應(yīng)體系；熱蓋溫度可調(diào)節(jié) | 用于反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) |
| 漩渦振蕩器* | — | 混勻試劑 |
| 微型離心機* | 兼容0.2mL、八連排和1.5mL 離心管 | 瞬時離心 |
| 震蕩水浴鍋* | 37℃恒溫 | 酶解離組織 |
| 生物安全柜 | 無菌環(huán)境 | 組織解離 |
| 光學(xué)顯微鏡 | 至少200x | 觀察形態(tài) |
| 75%乙醇 | 如果是無水乙醇，同時準(zhǔn)備去離子水 | 消毒 |
| 無塵紙 | — | — |
| 手術(shù)剪刀 | ～10cm | 剪碎組織 |
| 手術(shù)鑷子 | ～15cm | 夾取/轉(zhuǎn)移組織 |
| 無酶吸頭 | 1mL/200uL/10uL多種規(guī)格無酶吸頭 | — |
| 離心管架 | 可放置15ml、50ml離心管 | 放置離心管 |
| 離心管 | 0.2/1.5/ 2.0/15/ 50 mL滅菌離心管 | — |
注意事項：
1）標(biāo)記*的設(shè)備需放置在同一房間；
2）實驗臺大小要求能滿足兩名實驗員操作；
3）三孔儀器電源插座大于3 個；
4）生物安全柜可用常規(guī)實驗臺代替。
4.3 風(fēng)險提示與評估
1）組織保存液寄送樣本盡量保證48h內(nèi)寄送到實驗室開展實驗，時間過長會影響細(xì)胞活率及細(xì)胞表達(dá)狀態(tài)；
2）單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組組織樣本一定要備份進行質(zhì)檢（RIN值≥6.0），RNA完整性會影響數(shù)據(jù)結(jié)果；
3）細(xì)胞活率低于85%，可能引起mRNA部分降解導(dǎo)致基因檢出減少，細(xì)胞內(nèi)線粒體基因比例偏高，占用有效數(shù)據(jù)量；
4）細(xì)胞直徑<40 μm（10x）或<60 μm（DG）細(xì)胞過大容易堵塞芯片，無法形成油包水，過大的細(xì)胞利用細(xì)胞篩過濾；
5）細(xì)胞結(jié)團<15%，組織解離不充分，會看到細(xì)胞懸液中2個或多個細(xì)胞粘連在一起的情況，可能會導(dǎo)致最終數(shù)據(jù)中雙細(xì)胞占比偏多，占用有效數(shù)據(jù)量，結(jié)團過高還可能會堵塞芯片，無法形成油包水；
6）解離過程中可能由于解離條件過于劇烈而產(chǎn)生大量碎片，可能會導(dǎo)致背景噪音高，占用有效數(shù)據(jù)量，也會引起有效細(xì)胞數(shù)偏離預(yù)期。
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細(xì)胞學(xué)說提出“細(xì)胞是動物和植物結(jié)構(gòu)和生命活動的基本單位”，只有充分了解細(xì)胞的特性與功能，才能深入理解生命現(xiàn)象的深層機制，才能明晰生物體生長發(fā)育的規(guī)律，才能辨明疾病發(fā)生發(fā)展的原因。單細(xì)胞測序（single-cell sequencing）在單細(xì)胞水平研究細(xì)胞的功能和細(xì)胞互作網(wǎng)絡(luò)，幫助我們深層次理解生命機制。
2013-2020?年，單細(xì)胞測序技術(shù)多次被?Science、Nature?等學(xué)術(shù)期刊評價為年度重點技術(shù)，正引領(lǐng)新一輪生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)革命；在腫瘤、神經(jīng)學(xué)、免疫、感染性疾病、生長發(fā)育和生殖健康等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。
提到單細(xì)胞測序，我們腦中更多浮現(xiàn)得是scRNA-Seq(single-cell RNA -sequencing)；scRNA-seq是目前常用的單細(xì)胞測序技術(shù)，但是逐漸呈現(xiàn)出一些固有的方法學(xué)問題：組織類型偏好（無法分析難解離的組織和凍存組織等）；在細(xì)胞懸液制備中會引入一些轉(zhuǎn)錄偏好；組織解離時得到易于解離下來的細(xì)胞，敏感的細(xì)胞可能在解離時破碎；目前商業(yè)化的單細(xì)胞平臺都對細(xì)胞大小有限制等。
snRNA-seq(single-nucleus RNA-sequencing)以其獨特的優(yōu)勢受到研究者的青睞，逐漸呈現(xiàn)出較為火熱的景象。目前在多種動植物組織，如腫瘤組織[1]、腦[7]、腎臟[3]、心臟[8]和脂肪[4]中得到應(yīng)用，在植物單細(xì)胞中也逐漸展現(xiàn)了其優(yōu)勢[5]。snRNA-seq是否可以和scRNA-Seq一樣，得到一致的結(jié)果，解析生物學(xué)特征，兩者之間有哪些差異，下面幾篇文獻(xiàn)可以略解您的疑慮，帶您初識snRNA-seq。
scRNA-Seq和?snRNA-seq方法比較文獻(xiàn)解析
1、A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors.
發(fā)表雜志：Nature Medicine
影響因子：36.13
發(fā)表時間：2020. 6. 25
實驗平臺：10x Chromium
實驗材料：新鮮和凍存的8種腫瘤組織，如NSCLC（非小細(xì)胞肺癌）， ?NB（成神經(jīng)細(xì)胞瘤），MBC（轉(zhuǎn)移性乳腺癌），GBM（腦膠質(zhì)瘤），CLL（慢性淋巴細(xì)胞白血病），Ovarian（卵巢癌），Melanoma（黑色素瘤）和肉瘤。
研究內(nèi)容：開發(fā)了一種系統(tǒng)工具箱，可以分別通過scRNA-Seq和 ?snRNA-Seq對新鮮和冷凍的臨床腫瘤樣品進行分析；對同樣的樣品進行scRNA-Seq和snRNA-Seq分析，結(jié)果顯示它們可以得到相同的細(xì)胞類型，但是每種細(xì)胞類型的占比不同。
主要結(jié)果：
a.?建立了系統(tǒng)性的scRNA-Seq和snRNA-Seq的實驗流程和數(shù)據(jù)分析流程
研究了8種不同類型的腫瘤組織，通過不同取樣方式，共獲得不同部位共23個標(biāo)本的40個樣品的216,490個細(xì)胞和細(xì)胞核，這些樣品具有豐富的組織和樣品多樣性；對不同的細(xì)胞和細(xì)胞核分離方式，在實驗和數(shù)據(jù)分析中對細(xì)胞/細(xì)胞核質(zhì)量、細(xì)胞/細(xì)胞核回收率、靈敏度、細(xì)胞類型和CNV 分析等方面進行評估，確定了實驗流程和數(shù)據(jù)分析流程（圖1-1）；通過對8種腫瘤組織實驗和數(shù)據(jù)分析結(jié)果比較，推薦了細(xì)胞和細(xì)胞核分離方式（圖1-2）。
圖1-1 sc/snRNA-Seq 實驗和數(shù)據(jù)分析流程
圖1-2 不同腫瘤組織樣品信息和細(xì)胞/細(xì)胞核分離方式
對成神經(jīng)細(xì)胞瘤（HTAPP-656）、轉(zhuǎn)移性乳腺癌?(HTAPP-963)、CLL (CLL1) 和 O-PDX (O-PDX1)相同的樣品同時進行scRNA-Seq和snRNA-Seq分析。兩種方法可以得到相同的細(xì)胞類型，但是每種細(xì)胞類型的占比不同；在成神經(jīng)細(xì)胞瘤和轉(zhuǎn)移性乳腺癌中，scRNA-Seq獲得更多的免疫細(xì)胞，snRNA-Seq得到更多的惡性腫瘤細(xì)胞（圖1-3）；細(xì)胞檢測到解離信號的比例比細(xì)胞核高，且信號值較高；在細(xì)胞和細(xì)胞核中，免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的解離信號更加明顯（圖1-4）。
圖1-3 scRNA-Seq and snRNA-Seq結(jié)果比較
圖1-4 ?scRNA-Seq and snRNA-Seq解離信號比較
2.Systematic comparison of single-cell and?single-nucleus RNA-sequencing methods
發(fā)表雜志：Nature biotechnology影響因子：36.558發(fā)表時間：2020. 4. 6實驗平臺：scRNA-Seq:低通量(Smart-seq2和CEL-Seq2）和高通量(10x Chromium、Drop-Seq、Seq-Well、inDrops和sci-RNA-seq)snRNA-Seq:Smart-seq2、10x Chromium、DroNc-Seq和sci-RNA-seq
scRNA-Seq：人（HEK293）和小鼠（NIH3T3）等比例混合細(xì)胞系和凍存人類PBMC（2個生物學(xué)重復(fù)）；snRNA-Seq：凍存小鼠大腦皮層（2個生物學(xué)重復(fù)）Bulk RNA-Seq：以上3種材料
研究內(nèi)容：選擇2種低通量和5種高通量方法進行scRNA-Seq或snRNA-Seq分析；為了直接比較、避免每種方法已有流程的影響，作者開發(fā)了一種更加靈活、適用于任何scRNA-Seq的方法“scumi”；通過比較reads的結(jié)構(gòu)和比對情況、靈敏度、多胞率和解釋已知的生物學(xué)信息評估每種方法；兩種低通量方法表現(xiàn)相似，CEL-Seq2受其他細(xì)胞污染reads的影響比較明顯；10x Chromium在高通量方法中表現(xiàn)更優(yōu)。
首先，開發(fā)了“scumi”軟件包，從FASTQ文件到產(chǎn)生適用下游分析的基因和細(xì)胞參數(shù)；其次，提出了下游分析前過濾低質(zhì)量細(xì)胞的方案，這也是數(shù)據(jù)預(yù)處理的重要挑戰(zhàn)，然后對每個實驗類型每個細(xì)胞進行相同的reads數(shù)分析；最后，通過關(guān)鍵的參數(shù)對每種方法進行評估：①比對到細(xì)胞核和線粒體基因組的reads 及其結(jié)構(gòu)；②捕獲RNA的靈敏度；③多胞率；④準(zhǔn)確性和重復(fù)性；⑤得到細(xì)胞類型中重要的生物學(xué)差異的能力（圖2-1）。
圖2-1 scumi數(shù)據(jù)分析流程
b.?reads結(jié)構(gòu)和比對到基因組的信息顯示不同方法具有效率差異結(jié)果顯示，不同的方法在預(yù)期的位置沒有Poly（T）reads比例明顯不同；外顯子、內(nèi)含子、基因間、重疊的差異基因、多重比對以及無法比對的reads不同方法間基本一致；但是細(xì)胞核中內(nèi)含子reads與外顯子reads的比率明顯高于細(xì)胞，因為細(xì)胞核中有較高比例未剪切的轉(zhuǎn)錄本（圖2-2）。
圖2-2 測序reads的基因組比對特征（a. Mixture, b.PBMCs, c.Cortex ）
c.?不同實驗每種方法的靈敏度相對一致
結(jié)通過分析每個細(xì)胞的reads數(shù)、UMIs 和基因數(shù)比較每種方法的靈敏度（即捕獲RNA的能力）；7種方法中，低通量方法靈敏度最高，高通量方法中10x Chromium 每個細(xì)胞檢測到的UMI和基因數(shù)最多（圖2-3）。
圖2-3不同實驗每種方法的靈敏度比較
d.?不同的方法區(qū)別和獲得細(xì)胞類型的能力不同
選擇轉(zhuǎn)錄組分析方法最重要的一項指標(biāo)就是這種方法能否解釋感興趣的生物學(xué)信息。為了更加公平的分析每種方法，我們對數(shù)據(jù)進行了一致性處理；選擇相同的Reads/cell 和cells/實驗進行細(xì)胞分群和細(xì)胞類型鑒定。
在PBMCs中，每種方法都可以獲得豐富的細(xì)胞類型，但是每種類型的豐度不同，且獲得稀有細(xì)胞類型的能力有差異（如漿狀樹突細(xì)胞）；每種方法都有一定程度的血小板污染。
在大腦皮層中，細(xì)胞核分析得到小鼠大腦皮層多種細(xì)胞類型，包括興奮和抑制性神經(jīng)元,星形膠質(zhì)細(xì)胞,少膠質(zhì)細(xì)胞,少突膠質(zhì)祖細(xì)胞,小膠質(zhì)細(xì)胞,內(nèi)皮細(xì)胞和周皮細(xì)胞，其中周皮細(xì)胞只在DroNc-Seq Cortex1 中發(fā)現(xiàn)；sci-RNA-seq未得到少突膠質(zhì)祖細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞（圖2-4）。
圖2-4不同實驗不同方法細(xì)胞類型的比較
3.Advantages of Single-Nucleus over Single-Cell RNA?Sequencing of Adult Kidney: Rare Cell Types and Novel Cell States Revealed in Fibrosis
發(fā)表期刊：J Am Soc Nephrol
影響因子：9.274
發(fā)表時間：2019.1
實驗平臺：
scRNA-seq ：DropSeq
snRNA-seq：sNuc-DropSeq, DroNc-seq和?10x Chromium
實驗材料：8周大的小鼠腎臟
研究內(nèi)容：
在比較分析中共產(chǎn)生?11,391?個轉(zhuǎn)錄本。scRNA-seq鑒定了10個細(xì)胞簇，包括一個人為解離誘導(dǎo)的壓力相應(yīng)基因群，但是未鑒定到腎小球細(xì)胞。相反，3種snRNA-seq都鑒定到更加多樣性的腎細(xì)胞類型，包括腎小球足細(xì)胞，系膜細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，未檢測到壓力響應(yīng)基因；檢測到的腎小球足細(xì)胞的比例是已知發(fā)表的scRNA-seq 數(shù)據(jù)的20倍（2.4% versus 0.12%）。更出乎意料的是，snRNA-seq和scRNA-seq 的基因檢測靈敏度一致。為了驗證snRNA-se方法的有效性，分析了經(jīng)過纖維化和炎癥UUO治療第14天冷凍腎組織，鑒定了罕見近腎小球細(xì)胞，新活化的近端小管和成纖維細(xì)胞細(xì)胞狀態(tài)，以及之前未知的腎小管間質(zhì)信號通路。
圖3-1?內(nèi)含子對snRNA-seq?數(shù)據(jù)的影響
b.?snRNA-seq鑒定了3個特有的細(xì)胞類型
將4種方法的數(shù)據(jù)整合分析，共鑒定了13個細(xì)胞簇，包括足細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞和腎小球膜細(xì)胞；3種snRNA-seq 檢測足細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞和閏細(xì)胞的靈敏度更高；但是scRNA-seq未檢測到任何足細(xì)胞。差異基因表達(dá)分析顯示，?71.4%?基因在細(xì)胞和細(xì)胞核中都被檢測到；在檢測到的基因中，僅僅?5.0%?在細(xì)胞中的表達(dá)量高于細(xì)胞核，6.4%的基因在細(xì)胞核中的表達(dá)量高于細(xì)胞（fold change>1.5，?P value <0.05）（圖3-2）；scRNA-seq高表達(dá)基因包括線粒體、核糖體基因和熱休克途徑中的基因；snRNA-seq高表達(dá)基因包括溶質(zhì)載體、轉(zhuǎn)錄因子和Non-coding?RNA基因。
圖3-2 ??snRNA-seq?和scRNA-seq?差異分析?
?c.??snRNA-seq?分析經(jīng)過纖維化和炎癥UUO治療的冷凍腎組織
圖3-3 ??snRNA-seq?對UUO治療冷凍腎組織的分析結(jié)果
snRNA-seq應(yīng)用好文推薦
4. snRNA-seq reveals a subpopulation of?adipocytes that regulates?thermogenesis
發(fā)表信息：Nature；2020.10.28；IF：42.778。
單細(xì)胞平臺：Smart-Seq2?和10x Chromium
推薦理由:
通過對小鼠和人進行單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)脂肪組織中的新的細(xì)胞類型P4；通過對marker基因Cyp2e1和Aldh1a1的深度分析確定P4的主要功能，如免疫熒光染色，基因過表達(dá)、基因敲除，共表達(dá)等功能驗證技術(shù)。證明了這個亞群通過醋酸鹽介導(dǎo)的調(diào)節(jié)其產(chǎn)熱能力來調(diào)節(jié)鄰近脂肪細(xì)胞的活動。人類脂肪組織中含有較高數(shù)量的該亞群細(xì)胞，這可能解釋了與小鼠脂肪組織相比，人的產(chǎn)熱活性較低的原因，并提示靶向該途徑可用于恢復(fù)產(chǎn)熱活性。
5. The impact of chromatin remodeling on gene expression at the single cell level in Arabidopsis thaliana?
發(fā)表信息：bioRxiv preprint；doi:?https://doi.org/10.1101/2020.07.27.223156；?2020.07.28
單細(xì)胞平臺：10x Chromium
推薦理由:
利用原生質(zhì)體進行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序困難重重，如原生質(zhì)體獲得困難（不同物種、不同發(fā)育時期和不同器官細(xì)胞壁成分不同），解離對基因表達(dá)的影響，原生質(zhì)體細(xì)胞大小超出平臺的限制等；為了克服原生質(zhì)體的困難，作者進行了單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組分析；與已經(jīng)發(fā)表的文章相比，不僅驗證了單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組可以對擬南芥根進行分析，同時還發(fā)現(xiàn)了3種新的細(xì)胞類型；通過單細(xì)胞ATAC-Seq和snRNA-Seq?多組學(xué)聯(lián)合分析揭示染色質(zhì)重塑對基因轉(zhuǎn)錄的影響，證明細(xì)胞類型特異性標(biāo)記基因也顯示細(xì)胞類型特異性的染色質(zhì)可及性模式。我們的數(shù)據(jù)表明，染色質(zhì)的不同重塑是在細(xì)胞類型水平上調(diào)控基因活動的關(guān)鍵機制。
結(jié)束語
綜上所述，snRNA-Seq?分析細(xì)胞核內(nèi)的RNA，可以解釋相應(yīng)的生物學(xué)信息；snRNA-Seq?含有較多未剪切的轉(zhuǎn)錄本，包含內(nèi)含子的序列進行分析，不僅可以提高提高RNA的捕獲能力，同時可以得到更多的稀有細(xì)胞類型；snRNA-seq解決了scRNA-seq中固有的一些問題，能夠獲得更為準(zhǔn)確可靠的結(jié)果。
近幾年來，snRNA-Seq受到越來越多的青睞，文獻(xiàn)增長趨勢較為迅速；為特殊樣品（如冷凍組織）的單細(xì)胞研究提供新的途徑；為細(xì)胞單細(xì)胞研究開辟了新的思路。
snRNA-Seq和scRNA-Seq?是目前解析各種生命現(xiàn)象、揭示各種生物學(xué)機制的強有力的技術(shù)手段，各有千秋，研究者需要結(jié)合自身的條件來確定；如scRNA-Seq在神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞激活態(tài)（microglial activation）的研究中更勝一籌[6]。我們期待越來越多的研究者來解析單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄學(xué)這浩瀚的星空，發(fā)現(xiàn)更多耀眼的星。
百邁客引進10xGenomics單細(xì)胞測序平臺，使用Chromium系統(tǒng)采用微流控、油滴包裹和barcode標(biāo)記等技術(shù)實現(xiàn)一次性分離、高效標(biāo)記捕獲；同時具有10x?單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組、空間轉(zhuǎn)錄組、單細(xì)胞免疫組庫、全長轉(zhuǎn)錄組測序，實現(xiàn)10x平臺全面優(yōu)質(zhì)服務(wù)；已經(jīng)具有大量單細(xì)胞分離捕獲，極低量RNA反轉(zhuǎn)錄擴增建庫成功經(jīng)驗；提供單細(xì)胞分離捕獲、反轉(zhuǎn)錄建庫、測序、標(biāo)準(zhǔn)分析和高級分析全套單細(xì)胞測序服務(wù)；強大的生信團隊不僅提供基本分析，還提供細(xì)胞分化軌跡分析等多種高級分析；資深單細(xì)胞技術(shù)人員為您提供專業(yè)的課題方案設(shè)計，為您量身訂造專屬個性化分析。點擊下方按鈕聯(lián)系我們，將可免費獲得文章思路設(shè)計方案。
參考文獻(xiàn)
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[2]Systematic comparison of single-cell and ?single-nucleus RNA-sequencing methods.Jiarui Ding, Xian Adiconis, Sean K. Simmons, et al.Nature Biotechnology,Nat Biotechnol. 2020 Jun,38(6):737-746
[3]Advantages of Single-Nucleus over Single-Cell RNA Sequencing of Adult Kidney: Rare Cell Types and Novel Cell States Revealed in Fibrosis.Haojia Wu, Yuhei Kirita, Erinn L. Donnelly,et al.J Am Soc Nephrol,2019(30): 23-32
[4]snRNA-seq reveals a subpopulation of adipocytes that regulates thermogenesis.Wenfei Sun,Hua Dong,Miroslav Balaz, et al.Published online: 28 October 2020.
[5]Andrew Farmer1, Sandra Thibivilliers , Kook Hui Ryu,??et al.The impact of chromatin remodeling on gene expression at the single cell level in Arabidopsis thaliana.bioRxiv preprint,doi: https://doi.org/10.1101/2020.07.27.223156;2020.07.28
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[7]Dissecting Cell-Type Composition and Activity_Dependent Transcriptional State in Mammalian Brains by Massively Parallel Single-Nucleus RNA-Seq.Peng Hu, Emily Fabyanic,Deborah Y. Kwon, Sheng Tang,Zhaolan Zhou, Hao Wu.Molecular Cell.2017(68):1006–1015
[8]Systematic Comparison of High throughput Single-Cell and Single Nucleus Transcriptomes during Cardiomyocyte Diferentiation.Alan Selewa1, Ryan Dohn1, Heather Eckart, et al.Nature Scientific Reports | (2020) 10:1535
]]>中文題目：scWGS揭示阿爾茨海默病神經(jīng)元的體細(xì)胞基因組遺傳變化
英文題目：Somatic genomic changes in single Alzheimer’s disease neurons
發(fā)表雜志：Nature
影響因子：69.5
發(fā)表日期：202204
發(fā)表單位：哈弗醫(yī)學(xué)院
研究背景
阿爾茨海默氏癥的癡呆癥隨著神經(jīng)變性的進展而發(fā)展，但導(dǎo)致神經(jīng)元功能障礙和死亡的具體事件仍然鮮為人知。在正常衰老期間，神經(jīng)元以類似于分裂細(xì)胞的速度逐漸積累軀體突變，這表明遺傳因素、環(huán)境暴露或疾病狀態(tài)可能會影響這種積累在這里，本文分析了來自阿爾茨海默病患者和神經(jīng)典型對照個體前額葉皮層和海馬體的319個神經(jīng)元的單細(xì)胞全基因組測序（scWGS）數(shù)據(jù)。發(fā)現(xiàn)阿爾茨海默氏癥患者的體細(xì)胞DNA改變增加，分子模式不同，正常神經(jīng)元主要以與年齡相關(guān)的模式（特征A）積累突變，這與之前在健康和癌細(xì)胞中描述的“時鐘狀”突變特征非常相似。神經(jīng)變性中DNA改變的異常積累為阿爾茨海默病發(fā)展過程中發(fā)生的分子和細(xì)胞事件的級聯(lián)提供了見解。
材料方法
材料：年輕的神經(jīng)典型對照組（9人）、老年神經(jīng)典型對照組（11人）、阿爾茨海默氏病患者（9人）；一共29人，總計：319個神經(jīng)元，172個PFC-MDA神經(jīng)元，78個HC-MDA神經(jīng)元，69個PFC-PTA神經(jīng)元
方法：對319個神經(jīng)元進行單細(xì)胞全基因組測序。
研究結(jié)論
AD患者大腦中的興奮性神經(jīng)元積累的基因組損傷——以及可能的永久性突變——超過了僅因衰老而發(fā)生的水平。AD神經(jīng)元中基因組SNV積累的模式似乎與正常衰老的加重不同，這表現(xiàn)為（1）特征C的豐富，特征C存在于神經(jīng)典型對照個體的大腦中，但有限；（2）特征特異性轉(zhuǎn)錄影響。這些基因組變化可能包括一系列表現(xiàn)形式，包括單鏈DNA病變和雙鏈突變。AD神經(jīng)元體細(xì)胞改變的具體模式還提供了關(guān)于其原因和AD發(fā)病機制潛在影響的線索并確定潛在的治療目標(biāo)，scWGS技術(shù)深度揭示AD疾病發(fā)病機制與體細(xì)胞突變的積累有關(guān)，為其治療提供了理論基礎(chǔ)。
技術(shù)路線圖
主要研究結(jié)果
1、衰老期間神經(jīng)元的體細(xì)胞突變
對從AD和神經(jīng)典型對照個體的大腦中分離出來的神經(jīng)元進行了單細(xì)胞全基因組測序（scWGS），染色了泛神經(jīng)元標(biāo)記NeuN來標(biāo)記神經(jīng)元，并進一步只標(biāo)記了大的NeuN陽性核，使用多位移放大（MDA）進行全基因組擴增，分析了8例AD的91個神經(jīng)元和18個神經(jīng)典型對照組的159個神經(jīng)元。在神經(jīng)典型個體中，神經(jīng)元sSNVs隨著年齡的增長而增加，sSNVs的年增長率相當(dāng)高，從每年13到55個sSNV不等，在一些特殊細(xì)胞類型中，分裂突變率更高。沒有神經(jīng)診斷的個體的海馬CA1神經(jīng)元顯示，隨著年齡的增長，sSNVs呈積累的趨勢，這與神經(jīng)典型對照個體前額葉皮層（PFC）神經(jīng)元中看到的sSNV的增加沒有顯著差異。
圖1 對照個體和AD個體中單個神經(jīng)元的體細(xì)胞突變
在正常的PFC神經(jīng)元中，與年齡相關(guān)的突變增加主要由某些C>T和T>C變化驅(qū)動，從PFC和海馬錐體神經(jīng)元的復(fù)合數(shù)據(jù)集中對sSNVs進行簽名分解分析表明，簽名A在每個神經(jīng)元中的貢獻(xiàn)隨著年齡的增長而增加，每年獲得15.0±1.2 sSNVs。這種與年齡相關(guān)的特征A突變的增加與PFC和海馬錐體神經(jīng)元相似（P = 0.18，線性混合模型），并且是正常神經(jīng)元中與年齡相關(guān)的sSNV積累的主要驅(qū)動因素。轉(zhuǎn)錄可以通過轉(zhuǎn)錄相關(guān)損傷或無效修復(fù)使表達(dá)的位點對軀體突變敏感。
2、AD中的體細(xì)胞突變特征分析
評估了8名AD患者大腦神經(jīng)元中sSNVs的負(fù)擔(dān)，發(fā)現(xiàn)AD神經(jīng)元sSNVs明顯高于預(yù)期。AD神經(jīng)元在MDA實驗中也顯示sSNVs顯著增加。在PFC中，在八例AD個體病例中觀察到AD中sSNVs相對于正常衰老的顯著增加。AD中sSNV計數(shù)高的幾個基因組來自海馬體，其中8例中有5例與正常衰老相比，sSNVs顯著增加。AD中的神經(jīng)元包含數(shù)百種額外的sSNV，超出了其年齡的預(yù)期，這表明該疾病過程產(chǎn)生的基因組損傷水平與十多年來sSNV的正常積累相當(dāng)。變異的廣泛基因組分布表明，體細(xì)胞突變不是構(gòu)成疾病發(fā)病機制的特定初始事件，而是繼發(fā)性的，這是由引發(fā)AD和誘變過程的其他事件引起的。
AD神經(jīng)元的突變特征分析，在所有樣本中，A突變都會隨著年齡的增長而增加，這表明這種時鐘狀特征（與癌癥5的時鐘樣特征SBS5最相似）構(gòu)成了基因組老化的固有特征。簽名A還顯示，相對于年齡匹配的控制，AD略有增加，這在這些MDA實驗中沒有達(dá)到統(tǒng)計學(xué)意義，但表明這些突變機制在疾病環(huán)境中可能會被強調(diào)。另一方面，AD神經(jīng)元與對照組相比，簽名C明顯增加。鑒于AD4.31-33中報告了活性氧（ROS）和氧化核酸病變的增加，在AD中積累標(biāo)志性C的合理機制是，氧化損傷的增加壓倒了NER，而NER也可能在AD中也會減弱。
圖2 AD中的體細(xì)胞突變特征
由于我們的突變特征分析表明，DNA氧化——之前在AD4.11患者大腦的批量分析中觀察到——可能會導(dǎo)致AD中過量的sSNV，使用針對8-oxoG的抗體進行免疫熒光顯微鏡顯示，AD神經(jīng)元中的8-oxoG水平明顯高于神經(jīng)典型對照神經(jīng)元。表明氧化核苷酸損傷水平的增加有助于C>A變化和AD神經(jīng)元中標(biāo)志性C的增加。
對神經(jīng)元功能和生存至關(guān)重要的基因突變可能會直接影響細(xì)胞適應(yīng)性，對于簽名A，轉(zhuǎn)錄期間的事件似乎在產(chǎn)生突變方面發(fā)揮作用，而簽名C與表達(dá)式成反比，因此可以在轉(zhuǎn)錄期間更有效地修復(fù)，包括通過TC-NER35修復(fù)。對AD和對照神經(jīng)元中位突變的基因本體學(xué)（GO）分析顯示，參與神經(jīng)元功能的基因被sSNVs豐富。當(dāng)與表達(dá)式-sSNV結(jié)果一起考慮時，AD神經(jīng)元顯示轉(zhuǎn)錄過程對突變生成的影響，這種轉(zhuǎn)錄影響可以在配對的DNA鏈上產(chǎn)生不對稱的突變模式。
在蛋白質(zhì)編碼基因中，AD神經(jīng)元表現(xiàn)出比年齡匹配的對照神經(jīng)元表現(xiàn)出更多的非同義突變，對AD37腦脊液和腦組織中的克隆CD8+ T細(xì)胞的觀察表明，這種自激活可能與AD有關(guān)。功能失調(diào)的神經(jīng)元在AD中會明顯更豐富，這可能會因某些AD相關(guān)基因的長度而加劇；因此損害神經(jīng)元功能可能是sSNVs影響細(xì)胞生理學(xué)的一種方式。
圖3 AD中的體細(xì)胞突變對轉(zhuǎn)錄組和蛋白表達(dá)的影響
3、PTA擴增對AD神經(jīng)元基因組突變特征分析
基于PTA（初級模板定向放大）的人類神經(jīng)元scWGS證實，體細(xì)胞突變隨著年齡的增長而增加。對MDA分析的大多數(shù)大腦的神經(jīng)元小樣本（來自7例AD的29個神經(jīng)元和13個神經(jīng)典型對照組的40個神經(jīng)元）進行了基于PTA的scWGS，并確認(rèn)AD神經(jīng)元與對照組相比包含更多的改變，PTA檢測到的sSNVs代表雙鏈體細(xì)胞突變。
PTA檢測到的突變，這再次證實了簽名A突變以時鐘般的方式隨著年齡的增長而增加，AD神經(jīng)元中的簽名A略有顯著增加（P = 0.04，線性混合模型）。AD神經(jīng)元總突變的增加一樣，PTA突變特征發(fā)現(xiàn)反映了MDA放大神經(jīng)元基因組的趨勢。其中包括SBS8和SBS30，它們與DNA修復(fù)酶NTHL1有關(guān)，NTHL1參與氧化性病變修復(fù)。轉(zhuǎn)錄區(qū)域PTA檢測到的sSNVs負(fù)荷與大腦中的基因表達(dá)水平相關(guān)，而簽名A和C突變顯示的模式與MDA檢測到的sSNV相似，指出轉(zhuǎn)錄活動對突變發(fā)生的特殊影響。因此，兩種scWGS方法都確定了類似的模式，并表明AD中的致病突變機制包括DNA氧化、NER DNA修復(fù)和轉(zhuǎn)錄活性。
圖4. PTA對單個AD神經(jīng)元的體細(xì)胞突變分析
總結(jié)
兩種不同的單細(xì)胞全基因組測序技術(shù)揭示了AD患者大腦中的興奮性神經(jīng)元積累的基因組損傷——以及可能的永久性突變——超過了僅因衰老而發(fā)生的水平，未來探索更多的體細(xì)胞突變模式解釋這些氧化性病變?nèi)绾瓮ㄟ^與衰老過程中發(fā)生的突變相互作用來損害基因組功能。
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參考文獻(xiàn)
Miller MB, Huang AY, Kim J, et.al. Somatic genomic changes in single Alzheimer’s disease neurons. Nature. 2022 Apr;604(7907):714-722. doi: 10.1038/s41586-022-04640-1.
文章題目：T-cell dysfunction in the glioblastoma microenvironment is mediated by myeloid cells releasing interleukin-10
發(fā)表期刊：Nature Communications
影響因子：17.694
研究背景
膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是一種起源于腦部膠質(zhì)細(xì)胞的、顱內(nèi)常見的惡性腫瘤，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤通常發(fā)生于成人，其累及大腦的頻率高于脊髓。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤有時也稱為多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）或IV級星形細(xì)胞瘤。由于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤誘導(dǎo)表型發(fā)生變化后，腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞相互作用，促進腫瘤細(xì)胞生長，浸潤腦組織、抑制免疫反應(yīng)和誘導(dǎo)血管再生。同時腫瘤細(xì)胞還能夠改變內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元等正常腦細(xì)胞，形成有利于腫瘤生長的微環(huán)境，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞快速生長，并對治療產(chǎn)生抗性。
今天分享一篇2022年3月發(fā)表在Nature Communications上的一篇名為“T-cell dysfunction in the glioblastoma microenvironment is mediated by myeloid cells releasing interleukin-10”的文章，這篇文章中作者通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序與空間轉(zhuǎn)錄組測序相結(jié)合的方法，發(fā)現(xiàn)了髓系細(xì)胞分泌的白介素-10（IL-10）驅(qū)動膠質(zhì)母細(xì)胞瘤微環(huán)境中的T細(xì)胞功能障礙，最后導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生長，以及抑制免疫反應(yīng)。
實驗設(shè)計
髓樣細(xì)胞分泌IL-10驅(qū)動T細(xì)胞耗竭
該團隊對?8?名診斷為新發(fā)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的患者腫瘤組織樣本進行了單細(xì)胞測序和數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)“S1”狀態(tài)與?T?細(xì)胞耗竭/功能障礙標(biāo)志物（HAVCR2、CTLA4?和?PDCD1）的表達(dá)增加，為了確定與?T?細(xì)胞耗竭相關(guān)的轉(zhuǎn)錄途徑，進行了通路信號傳導(dǎo)推斷，揭?示了?T?細(xì)胞耗竭與?IL-10?以及部分?TGF??反應(yīng)之間存在著相關(guān)性。
T?細(xì)胞中?IL-10?下游信號傳導(dǎo)通路反應(yīng)的擾動模擬驗證
該團隊通過擾動模擬，用IL-10刺激所產(chǎn)生scRNA-seq數(shù)據(jù)集富集分析推斷常見轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，發(fā)現(xiàn)ChiP-seq數(shù)據(jù)中基因BLIMP-1和IRF1峰之間密切重疊，IRF1和PRDM1/14結(jié)合位點的顯著富集，提出了“IL10-STAT3-BLIMP-1信號軸可能是腫瘤相關(guān)T細(xì)胞耗竭的潛在驅(qū)動因素”的假設(shè)。為了進一步驗證猜想，作者對PRDM1進行了計算機擾動模擬驗證，發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤母細(xì)胞瘤微環(huán)境中髓樣細(xì)胞分泌IL-10驅(qū)動誘發(fā)T?細(xì)胞耗竭。
空間轉(zhuǎn)錄組測序確定T?細(xì)胞的空間分布
為了確定?T?細(xì)胞簇的空間位置信息，以及與特定腫瘤狀態(tài)共定位信息，作者進行了空間分辨轉(zhuǎn)錄組RNA測序(stRNAseq)。該團隊收集3名原發(fā)性GBM IDH1/2 Wt患者組織樣本，數(shù)據(jù)集總共包含2352個測序點，每個點的中位數(shù)為8個細(xì)胞（范圍：每個spot點捕獲4~22個細(xì)胞）。作者通過NMF回歸和Moran統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞簇與GBM亞型相關(guān)聯(lián)，腫瘤區(qū)域富集為間充質(zhì)樣腫瘤（MES樣），星形膠質(zhì)細(xì)胞樣（AC樣）轉(zhuǎn)錄特征與活化的CD8+效應(yīng)子、CD8+T耗盡簇共定位。
總之，這篇文章中作者通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序、空間轉(zhuǎn)錄組測序、擾動模擬等手段，驗證了空間上定位于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）間充質(zhì)樣亞群中的髓樣細(xì)胞分泌IL-10驅(qū)動T細(xì)胞耗竭，導(dǎo)致抑制性免疫微環(huán)境，促進腫瘤進展。這些研究成果對于臨床治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤疾病提供了新的治療方案。除此之外，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序&空間轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在該研究中，起到了關(guān)鍵性作用。
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文章：Metastatic recurrence in colorectal cancer arises from residual EMP1+ cells
期刊：Nature
影響因子：49.962
研究背景
結(jié)腸癌（CRC）是胃腸道中常見的惡性腫瘤，早期癥狀不明顯，隨著癌腫的增大而表現(xiàn)出便血、腹瀉、局部腹痛等癥狀，晚期則表現(xiàn)貧血、體重減輕等全身癥狀。其發(fā)病率和病死率是僅次于肺癌的第三種惡性腫瘤疾病。據(jù)不完全統(tǒng)計，我國大約有20%患者被診斷出結(jié)直腸癌時，已經(jīng)處于癌癥晚期了，且結(jié)腸癌死亡的主要原因是腫瘤轉(zhuǎn)移和疾病復(fù)發(fā)。研究發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)預(yù)測CRC疾病復(fù)發(fā)高風(fēng)險的基因由腫瘤微環(huán)境(TME)的細(xì)胞表達(dá)，特別是癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAF)表達(dá)。因此，消除相關(guān)腫瘤細(xì)胞表達(dá)并預(yù)防結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)，是目前臨床診斷研究比較炙熱的關(guān)注點。2022年11月9日，來自西班牙巴塞羅那科學(xué)技術(shù)研究所的研究人員在Nature上一篇名為“Metastatic recurrence in colorectal cancer arises from residual EMP1+ cells”的文章，該文首次發(fā)現(xiàn)了隱藏在肝臟和肺部中的殘余腫瘤細(xì)胞，并描述了它們?nèi)绾窝葑優(yōu)檫@些器官中出現(xiàn)的轉(zhuǎn)移瘤。
實驗設(shè)計
確定高復(fù)發(fā)細(xì)胞(HRCs)
該團隊通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序(scRNA-seq）手段，首先對CRC患者樣本進行數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)不良預(yù)后基因是由一群獨特的腫瘤細(xì)胞（包括：CAFs、內(nèi)皮細(xì)胞以及較小程度上髓系細(xì)胞）表達(dá)的，該團隊將其命名為高復(fù)發(fā)細(xì)胞（high-relapsecells，HRCs）。
接著研究團隊建立了CRC小鼠模型，模擬手術(shù)切除原發(fā)腫瘤后發(fā)生轉(zhuǎn)移性復(fù)發(fā)的過程。發(fā)現(xiàn)原發(fā)性CRC手術(shù)后，小鼠肝臟中殘留的HRCs的增殖活動很少，對原發(fā)性結(jié)腸癌的生長沒有貢獻(xiàn)。但隨著時間的推移，殘留的HRCs會產(chǎn)生多種細(xì)胞類型，包括LGR5干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞。這群HRC細(xì)胞能夠脫離原發(fā)性結(jié)腸癌，遷移到血液中，到達(dá)肝臟，并在手術(shù)后隱藏一段時間，隨后引發(fā)明顯的腫瘤轉(zhuǎn)移。
殘留的EMP1+細(xì)胞導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)
為了找到結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移性復(fù)發(fā)的真正來源，研究人員借助人和小鼠模型，借助單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)(scRNA-seq），發(fā)現(xiàn)EMP1在 HRCs細(xì)胞中高表達(dá)，且與EpiHR基因的表達(dá)有很大的重疊。進一步通過細(xì)胞消融實驗，證明了導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)來源于殘留的EMP1陽性細(xì)胞。
總之，這些研究成果對于臨床治療結(jié)直腸癌疾病提供了新的治療方案，這種新型的輔助免疫治療可預(yù)防結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移性復(fù)發(fā)。除此之外，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在該研究中，對腫瘤微環(huán)境、腫瘤細(xì)胞之間異質(zhì)性、細(xì)胞亞型及狀態(tài)等研究方面，起到了關(guān)鍵性作用。
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標(biāo)題：Integrated single-cell transcriptomic analyses reveal that GPNMB-high macrophages promote PN-MES transition and impede T cell activation in GBM
發(fā)表雜志：EBioMedicine（IF=11.205）
發(fā)表時間：202209
研究背景
膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）是具有侵襲性的原發(fā)性腦腫瘤類型，通常對目前的治療具有耐藥性，以腫瘤微環(huán)境為中心的療法可能為GBM治療帶來新的希望。因此，迫切需要深入了解腫瘤-基質(zhì)通訊，以確定有希望的治療靶點。
研究方案設(shè)計
1、收集人、小鼠GBM的單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）數(shù)據(jù)、RNA-seq數(shù)據(jù)和空間轉(zhuǎn)錄組（Spatial transcriptomics，ST）數(shù)據(jù)；
2、免疫細(xì)胞分選
1）小鼠脾臟T cells：EasySep Mouse T Cell Isolation Kit (Stemcell Technologies; 19851) ；
2）單核細(xì)胞：RPMI-1640 medium (Life Technologies, 11875119)沖洗股骨和脛骨，40μm濾器過濾，EasySep Mouse Monocytes Isolation Kit (Stemcell Technologies; 19861)分選.；
3）CD11b+F4/80+GPNMB+ macrophages and CD11c+MHCII+ dendritic cells：anti-CD45 (1:200, eBioscience), anti-CD11b (1:200, eBioscience), anti-CD11c(1:200, BioLegend), anti-F4/80 (1:200, BioLegend), anti-MHCII (1:200, eBioscience) and anti-GPNMB (1:100, Invitrogen)。
3、流式分選：小鼠GBM細(xì)胞懸液抗體孵育30 mins，anti-CD45 (1:200, eBioscience)、anti-CD3 (1:100, BioLegend)、anti-CD11b (1:200, BioLegend)、anti-CD11c (1:200, BioLegend)、anti-F4/80 (1:200, BioLegend)、anti-MHCII (1:200, eBioscience) 、IgG antibodies對照；
4、免疫熒光：anti-GPNMB (1:50, R&D Systems)、anti-Mac-3 (1:100, BD)、anti-CD3(1:100, Abcam) 。
5、細(xì)胞共培養(yǎng)：前神經(jīng)元型膠質(zhì)瘤細(xì)胞和新鮮分離的CD11b+ F4/80+巨噬細(xì)胞，每三天加入新鮮的巨噬細(xì)胞，持續(xù)的刺激后檢測間充質(zhì)表型的三種主要轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)（EPAS1、CEBPB、FOSL2）。
數(shù)據(jù)分析方法
1、scRNA-seq數(shù)據(jù)處理：Seurat，低質(zhì)量細(xì)胞過濾（a cutoff value of less than 200 total feature RNA and more than 5% mitochondrial RNA）、SCTransform標(biāo)準(zhǔn)化、PCA降維（npcs=30）、細(xì)胞類群識別FindNeighbors and FindClusters（resolution=0.8）、差異分析FindAllMarkers function (cutoff:min.pct=0.25 and logfc.threshold=0.25)；
2、ST數(shù)據(jù)處理：Seurat 4.0，SCTransform標(biāo)準(zhǔn)化、 PCA and UMAP降維聚類（npcs=30）、SpatialFeaturePlot空間可視化；
3、腫瘤拷貝數(shù)據(jù)變異：inferCNV，過濾expressed less than 10 cells and a median expression below 0.1；
4、細(xì)胞軌跡分析：Monocle 2，過濾expression was less than 0.5 and expressed cells were fewer than 200；
5、轉(zhuǎn)錄因子活性：SCIENCE，相關(guān)性GENIE3 (treeMethod= ”RF”, K=”sqrt”, nTrees?=?1000)
6、細(xì)胞通訊：Nichenet（Only the top 15% expressed genes in sender cells were calculated by regulatory potentials and ligand activity was ranked with a cutoff of 0.5 using Pearson test）、CytoTalk（分析T cells、 dendritic cells、Gpnmb-high macrophages、monocytes）
研究思路
研究結(jié)果
1、scRNA-seq分析GBM腫瘤異質(zhì)性圖譜
利用Seurat整合分析了來自不同數(shù)據(jù)集的scRNA-seq數(shù)據(jù)（GSE103224、GSE138794、GSE139448和GSE131928），共獲得來自40例患者的54,534個細(xì)胞（圖1a）；利用inferCNV分析進一步鑒別腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞（圖1），與已發(fā)表的WES 數(shù)據(jù)一致；鑒定注釋到的惡性細(xì)胞包括：MES-like細(xì)胞（12.2%，CHI3L1、ADM）、AC-like細(xì)胞（36%，MLC1、HOPX）、NPC-like細(xì)胞（4.9%，CD24、DCX）和OPC-like細(xì)胞（26.4%，PDGFRA、OLIG1），非腫瘤細(xì)胞包括：巨噬細(xì)胞（8.2%，CD163、CD68）、小膠質(zhì)細(xì)胞（1.5%，CX3CR1、TMEM119）、淋巴細(xì)胞（0.7%，CD3D、NKG7）、內(nèi)皮細(xì)胞（1.1%，VWF、PECAM1）、腫瘤相關(guān)內(nèi)皮細(xì)胞（0.8%，COL1A2、BGN）、少突膠質(zhì)細(xì)胞（4.3%，PTGDS、MBP）（圖1c-d）；GBM患者表現(xiàn)出高水平的瘤內(nèi)異質(zhì)性，尤其是腫瘤細(xì)胞（圖1E-F）；GSEA分析也驗證了GBM的不同腫瘤細(xì)胞亞型（圖1g）。
圖1 scRNA-seq分析GBM腫瘤異質(zhì)性圖譜
2、軌跡分析揭示前神經(jīng)元-間充質(zhì)亞型轉(zhuǎn)換中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子
利用細(xì)胞軌跡分析，探索GBM不同腫瘤亞型間的分化關(guān)系，結(jié)果顯示擬時間線上主要由NPC-和OPC-like 腫瘤細(xì)胞逐漸分化為AC-和MES-like腫瘤細(xì)胞，同時有個小分支為AC-like腫瘤細(xì)胞，揭示了GBM的可塑性和前神經(jīng)元型（proneural, PN）到間質(zhì)型（mesenchymal, MES）的動態(tài)過渡（圖2a-c）；PN與細(xì)胞周期、G2M檢查點和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化相關(guān)的通路顯著富集，表明PN具有高度增殖性和可塑性，而MES與上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）、缺氧、ECM組織和細(xì)胞粘附相關(guān)的通路顯著富集（圖2d）；利用TCGA數(shù)據(jù)集進行生存分析，結(jié)果顯示，與PN組相比，具有MES-like轉(zhuǎn)錄組特征的患者總生存期較差，而與MES-low組相比，MES-high組預(yù)后更差，表明具有間充質(zhì)特征的GBM患者的生存結(jié)局較差（圖2e）。Tips：利用TCGA數(shù)據(jù)庫中的臨床數(shù)據(jù)，將單細(xì)胞數(shù)據(jù)中鑒定到關(guān)鍵maker基因或基因集進行生存分析，是探討臨床意義的有效途徑。
利用SCENIC分析PN或MES細(xì)胞中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)錄因子E2F1、SOX9、RARA、SOX11和SOX4在OPC和NPC細(xì)胞中差異過表達(dá)，而 EAPS1、CEBPB、FOSL2、STAT2和EGR1在MES和AC細(xì)胞狀態(tài)中差異過表達(dá)，細(xì)胞軌跡分析證實了PN-MES轉(zhuǎn)換過程中EPAS1、CEBPB和FOSL2的激活以及SOX4、SOX11的下調(diào)（圖2k）。以上結(jié)果突出了從PN到MES細(xì)胞狀態(tài)的動態(tài)轉(zhuǎn)變主要是由關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子驅(qū)動的。
圖2 軌跡分析揭示前神經(jīng)元-間充質(zhì)亞型轉(zhuǎn)換中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子
3、PN-和MES-GBM的腫瘤免疫微環(huán)境解析
利用MES基因特征將患者分為MES-high和MES-low組，發(fā)現(xiàn)MES-high組腫瘤微環(huán)境中伴有豐富的巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞浸潤（圖3a, b）；但T細(xì)胞浸潤在很多癌種的研究中與患者預(yù)后呈正相關(guān)，因此利用TCGA數(shù)據(jù)進一步分析，GBM MES亞型表達(dá)更高的T細(xì)胞和髓系細(xì)胞標(biāo)志物，并且T細(xì)胞與巨噬細(xì)胞存在很強的相關(guān)性（圖3c-d）；對空間scRNA-seq數(shù)據(jù)進行分析，發(fā)現(xiàn)CD8 + T細(xì)胞與CD68 +髓系細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞共定位（圖3e），證實了T細(xì)胞與髓系細(xì)胞之間存在空間上的緊密接觸，可能發(fā)生在血管微環(huán)境中（vascular niches）。Tips：每個實驗組增加ST樣本，不僅能與單細(xì)胞數(shù)據(jù)互相驗證，還能對maker基因和細(xì)胞類型進行空間定位，精準(zhǔn)鎖定有真實空間物理接觸的細(xì)胞間互作關(guān)系。
利用反卷積算法對TCGA數(shù)據(jù)進一步進行分析，發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞豐度與巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞顯著相關(guān)，這是兩個主要的髓系細(xì)胞（圖3f）；利用流式細(xì)胞術(shù)，分析小鼠GBM中的免疫細(xì)胞，證實了T細(xì)胞與CD11b + F480 +腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）或CD11c + MHCII + DC顯著正相關(guān)（圖3g）。因此，間充質(zhì)亞型中T細(xì)胞比例較高主要是由于巨噬細(xì)胞的浸潤。
圖3 PN-和MES-GBM的腫瘤免疫微環(huán)境解析
4、源自巨噬細(xì)胞的GPNMB有助于PN-MES細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變
利用NicheNet分析腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞間信號通訊，鑒定到了多個基質(zhì)細(xì)胞-腫瘤細(xì)胞相互調(diào)控的配體-受體對，其中預(yù)測到巨噬細(xì)胞高表達(dá)的GPNMB與大多數(shù)間充質(zhì)靶標(biāo)存在相互作用（圖4a），GPNMB是一種跨膜糖蛋白，最初是在腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的，參與腫瘤遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移，通過直接抑制T細(xì)胞活化來逃避免疫；Tips：基于個性化分析結(jié)果，優(yōu)先篩選TOP基因（顯著性、差異倍數(shù)、靶標(biāo)基因數(shù)目等），結(jié)合研究領(lǐng)域內(nèi)已有特定功能報道的基因或通路，可以幫助更快鎖定目標(biāo)分子。
HPA和TCGA數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，GPNMB主要在巨噬細(xì)胞中表達(dá)，并且與巨噬細(xì)胞標(biāo)志物顯著正相關(guān)，這表明巨噬細(xì)胞是GPNMB的主要來源（圖4b, c），流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果證實了GPNMB主要在巨噬細(xì)胞上表達(dá)，而不是樹突狀或腫瘤細(xì)胞。Tips：流式細(xì)胞術(shù)是單細(xì)胞測序常見的下游驗證方法，可用來分選目標(biāo)細(xì)胞類群、驗證細(xì)胞比例的變化和新鑒定的maker基因作為特定細(xì)胞分選的可行性等。
GPNMB在MES亞型患者中高表達(dá)，并且與低級別和高級別膠質(zhì)瘤的預(yù)后不良相關(guān)（圖4d, e）；推測高表達(dá)GPNMB的巨噬細(xì)胞可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞向MES表型轉(zhuǎn)變，進一步利用細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)來驗證這一假設(shè)，結(jié)果表明，長期接觸巨噬細(xì)胞可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中間充質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，并且靶向GPNMB的中和抗體治療可以部分消除這種作用，表明GPNMB是PN-MES狀態(tài)過渡的重要調(diào)節(jié)因子（圖4f）。
圖4 源自巨噬細(xì)胞的GPNMB有助于PN-MES細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變
5、小鼠scRNA-seq分析單核細(xì)胞分化為Gpnmb-high巨噬細(xì)胞
收集小鼠GBM scRNA-seq數(shù)據(jù)，重點關(guān)注在早期（d7）和晚期（d28）GBM小鼠的CD45 +免疫細(xì)胞。根據(jù)細(xì)胞maker基因表達(dá)鑒定到了NK cells、Cd8+ T cells、Cd4+ T cells、 B cells、neutrophils、cDC1、cDC2、pDC、mDC、monocytes、TAM、monocytes/TAM、microglia cells（圖5a）；與以往的報道類似，巨噬細(xì)胞隨著腫瘤進展急劇侵入腫瘤部位，而小膠質(zhì)細(xì)胞在腫瘤發(fā)展過程中逐漸消失（圖5b）；細(xì)胞軌跡分析推斷出樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞起源于單核細(xì)胞，并隨著腫瘤進展而逐漸分化（圖5c）；不同的通路主導(dǎo)了腫瘤浸潤T細(xì)胞的募集，單核細(xì)胞主要表達(dá)Cxcl10、Cxcl9、樹突狀細(xì)胞特異性表達(dá)Ccl17、Ccl22，而巨噬細(xì)胞表達(dá)Ccl24，Saa3、Arg1和Gpnmb僅在巨噬細(xì)胞中出現(xiàn)(圖5d）；在腫瘤發(fā)生過程中，Arg1和Gpnmb的表達(dá)在巨噬細(xì)胞中被強烈誘導(dǎo)（圖5e-g），這與人GBM數(shù)據(jù)集中的發(fā)現(xiàn)一致；然而，Gpnmb敲低后CD206（經(jīng)典M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志物）表達(dá)不變，提示GPNMB不是M2巨噬細(xì)胞極化的驅(qū)動因素；免疫熒光染色顯示GPNMB+巨噬細(xì)胞與T細(xì)胞共定位（圖5h），表明它們之間存在潛在的相互作用。
圖5 小鼠scRNA-seq分析單核細(xì)胞分化為Gpnmb-high巨噬細(xì)胞
6、GPNMB-high巨噬細(xì)胞影響DC激活T細(xì)胞
利用CytoTalk算法分析GBM中T細(xì)胞與APC-like細(xì)胞間的相互作用，研究完整的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，結(jié)果顯示，T細(xì)胞通過Chemokines、cytokines、co-stimulatory/inhibitory、antigen-presentation通路與單核細(xì)胞、Gpnmb-high巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞相互作用，并且DC細(xì)胞與Gpnmb-high巨噬細(xì)胞共享Cxcl16-Cxcr6趨化因子信號與T細(xì)胞相互作用。為了驗證Gpnmb-high巨噬細(xì)胞的調(diào)控機制，從GBM腫瘤和正常小鼠中提取F4/80 + GPNMB +巨噬細(xì)胞、D11c + DC和骨髓來源的單核細(xì)胞，然后與na?ve T細(xì)胞共培養(yǎng)（圖6e）；實驗結(jié)果顯示，與GPNMB+巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞相比，CD11c + DC共培養(yǎng)表達(dá)更高水平的CD69、IFNγ和GZMB，能更好地誘導(dǎo)T細(xì)胞活化（圖6f）；T細(xì)胞增殖實驗檢測結(jié)果也表明，與GPNMB+巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞相比，CD11c + DC能顯著促進T細(xì)胞增殖（圖6g）。綜合以上結(jié)果，確定了關(guān)鍵的GPNMB-high巨噬細(xì)胞亞群是GBM細(xì)胞間通訊的樞紐，不僅誘導(dǎo)PN-MES腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化，而且通過與DC競爭而損害T細(xì)胞激活。Tips：利用細(xì)胞通訊分析篩選潛在細(xì)胞間互作的受體-配體對，結(jié)合細(xì)胞共培養(yǎng)、co-IP和免疫熒光等實驗，可以探究目標(biāo)細(xì)胞類型對特定細(xì)胞功能的影響及機制。
圖6 GPNMB-high巨噬細(xì)胞影響DC激活T細(xì)胞
研究總結(jié)
1、本文通過scRNA-seq數(shù)據(jù)將高度異質(zhì)性的GBM腫瘤細(xì)胞分為MES-like、AC-like，OPC-like和NPC-like亞型；
2、利用細(xì)胞軌跡分析和轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析預(yù)測到由特定TF調(diào)節(jié)的PN到MES細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)換；
3、利用空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)、TCGA數(shù)據(jù)庫、細(xì)胞通訊分析，鎖定到了關(guān)鍵的GPNMB-high巨噬細(xì)胞，在PN-MES細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變中發(fā)揮重要作用；
4、通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分析和細(xì)胞共培養(yǎng)研究，進一步揭示了這些源自單核細(xì)胞的GPNMB高巨噬細(xì)胞亞群可能無效地保留T細(xì)胞不被樹突狀細(xì)胞激活，提示未來靶向GPNMB-high巨噬細(xì)胞的聯(lián)合免疫治療可作為有潛力的治療策略。
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參考文獻(xiàn)
Xiong A, Zhang J, Chen Y, Zhang Y, Yang F. Integrated single-cell transcriptomic analyses reveal that GPNMB-high macrophages promote PN-MES transition and impede T cell activation in GBM. EBioMedicine. 2022;83:104239. doi:10.1016/j.ebiom.2022.104239
單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)挖掘方向
| 數(shù)據(jù)處理? | 細(xì)胞分群注釋? | 差異分析? | 功能分析? | 細(xì)胞通訊分析? |
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| 發(fā)育軌跡分析? | 轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析? | 腫瘤異質(zhì)性分析? | 臨床相關(guān)性分析? | 單細(xì)胞聯(lián)合空間? |
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單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)個性化分析方法
單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)的挖掘方向復(fù)雜多樣，針對不同領(lǐng)域的生物學(xué)表型和機理研究，需要持續(xù)不斷地開發(fā)個性化分析內(nèi)容，從不同的角度進行個性化數(shù)據(jù)挖掘，以下就是單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)個性化分析的幾個分析方向：
1、單細(xì)胞測序個性化分析方法：細(xì)胞軌跡分析–揭示細(xì)胞發(fā)育分化動態(tài)軌跡
細(xì)胞軌跡分析可以在單細(xì)胞分辨率驗證已知的細(xì)胞分化關(guān)系，推斷未知的細(xì)胞分化路徑，挖掘一些稀少的中間狀態(tài)細(xì)胞，解析細(xì)胞分化過程中的起調(diào)控作用的關(guān)鍵基因，在發(fā)育生物學(xué)中細(xì)胞分化、譜系發(fā)育研究方向、腫瘤/疾病微環(huán)境中免疫細(xì)胞的動態(tài)變化研究中均有廣泛應(yīng)用。目前進行細(xì)胞軌跡分析的方法和軟件非常之多，大致可以概括為兩種方法，一種是以monocle軟件為代表的擬時序分析（pseudotime analysis），另一種則是以velocyto /scVelo為主的RNA速度分析（RNA velocity）。詳情>>單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析沒有思路？試試細(xì)胞軌跡分析~(內(nèi)附代碼)
2、單細(xì)胞測序個性化分析方法：細(xì)胞通訊分析–解析細(xì)胞間的信號通訊關(guān)系
多細(xì)胞生物是由很多不同類型細(xì)胞組成的開放而復(fù)雜體系，配體受體復(fù)合物介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊對協(xié)調(diào)發(fā)育、分化和炎癥等多種生物學(xué)過程至關(guān)重要。細(xì)胞通訊分析，又稱細(xì)胞受體-配體互作分析，是以細(xì)胞亞群的基因表達(dá)量數(shù)據(jù)為研究對象，通過獲得細(xì)胞中配體及受體基因的表達(dá)信息，比較細(xì)胞類型之間的配體與受體基因表達(dá)差異，分析得到細(xì)胞亞群間的信號通訊關(guān)系，在闡明生物學(xué)過程中細(xì)胞間通訊的復(fù)雜性、多樣性和動態(tài)性方面有重要意義。
3、單細(xì)胞測序個性化分析方法：GSEA/GSVA分析–基于功能基因集的富集分析策略
GSEA( Gene Set Enrichment Analysis)，是2005年由Broad Institute研究開發(fā)的一種基于基因集的富集分析方法，用來評估一個預(yù)先定義的基因集的基因在與表型相關(guān)度排序的基因表中的分布趨勢，從而判斷其對表型的貢獻(xiàn)。GSEA是從所有基因的表達(dá)豐度出發(fā)，分析在不同的通路中的基因的整體表達(dá)影響，這也是區(qū)別于GO/KEGG富集分析的地方，GSEA不需要設(shè)定差異閾值篩選目標(biāo)基因集，理論上更容易囊括細(xì)微但協(xié)調(diào)性的變化對生物通路的影響。Broad研究所在GSEA發(fā)布8年之后，開發(fā)了GSVA（Gene Set Variation Analysis）算法來拓展基因集分析的應(yīng)用。GSEA分析主要用于兩兩組間比較的方案設(shè)計中，對于分組比較復(fù)雜的方案設(shè)計則比較適合GSVA分析，GSVA不需要預(yù)先進行樣本之間的差異分析，依據(jù)表達(dá)矩陣就可以計算每個樣本中特定基因集的變異分?jǐn)?shù)。
4、單細(xì)胞測序個性化分析方法：腫瘤拷貝數(shù)變異分析–揭示惡性細(xì)胞表型
拷貝數(shù)變異(Copy number variation, CNV)是由基因組發(fā)生重排而導(dǎo)致的，基因組大片段的拷貝數(shù)增加或者減少，基因組結(jié)構(gòu)變異(Structural variation, SV) 的重要組成部分，也是人類疾病的重要致病因素之一。與正常細(xì)胞相比，腫瘤基因組部分區(qū)域呈現(xiàn)過表達(dá)或低表達(dá)狀態(tài)，通過與一組參考的“正常”細(xì)胞相比，比較不同樣本間或不同細(xì)胞類型之間的CNV基因表達(dá)差異，探索腫瘤基因組位置上基因的表達(dá)強度，最終反映基因大片段區(qū)域的CNV事件，鑒定體細(xì)胞整個染色體或大片段染色體的擴增或缺失。
5、單細(xì)胞測序個性化分析方法：轉(zhuǎn)錄因子活性分析–挖掘關(guān)鍵調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子
單細(xì)胞研究通常會涉及到一個核心關(guān)鍵問題：細(xì)胞的異質(zhì)性以及這種異質(zhì)性是如何發(fā)展和維持的。這種細(xì)胞異質(zhì)性很大程度上是由潛在的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)決定的，特定轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor，TF）集合的協(xié)同表達(dá)驅(qū)動各自靶標(biāo)基因的表達(dá)，從而建立特定的基因表達(dá)譜。因此，單細(xì)胞的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對于深入挖掘細(xì)胞異質(zhì)性背后的生物學(xué)意義是至關(guān)重要的。利用pySCENIC從單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中推斷TF、基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和細(xì)胞類型，基本原理是基于共表達(dá)和DNA調(diào)控保守序列（motif）分析推斷基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，然后在每個細(xì)胞中分析網(wǎng)絡(luò)活性以鑒定細(xì)胞狀態(tài)。
6:、單細(xì)胞測序個性化分析方法：加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析–篩選表型相關(guān)核心調(diào)控網(wǎng)絡(luò)
加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（Weighted Gene Co-expression Network Analysis, WGCNA）是構(gòu)建基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的常用方法，可以探索模塊與特定表型或疾病的關(guān)聯(lián)關(guān)系,最終達(dá)到鑒定基因網(wǎng)絡(luò)的目的；單細(xì)胞測序技術(shù)可以揭示特定腫瘤組織中的細(xì)胞特異性，對細(xì)胞進行分類，并且識別特定的標(biāo)志物，但其檢測的細(xì)胞數(shù)量和病例來源都是有限的。利用WGCNA分析單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，可以提供一套有別于高変基因、差異分析的方法，不依賴于數(shù)據(jù)庫直接用表達(dá)量的相關(guān)性值預(yù)測調(diào)控關(guān)系，篩選某些細(xì)胞亞群中有關(guān)聯(lián)作用的基因集（稱為模塊），可以從成千上萬的基因中挑選出高度相關(guān)的基因的模塊，并將模塊與表型進行關(guān)聯(lián)，尋找marker gene或治療靶點。
7、單細(xì)胞測序個性化分析方法：單細(xì)胞空間聯(lián)合分析-解析空間結(jié)構(gòu)異質(zhì)性
基因表達(dá)具有時間和空間特異性，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組主要從時間上研究基因表達(dá)，能夠系統(tǒng)的識別組織中的細(xì)胞亞群，但沒有捕獲其空間組織信息，限制了我們對組織及細(xì)胞間相互作用的理解。而空間轉(zhuǎn)錄組的應(yīng)用使得人們能夠從空間的角度解析數(shù)據(jù)，在空間上研究基因的表達(dá)。通過整合兩種數(shù)據(jù)模式，將單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行聯(lián)合分析，在時空上分析基因的表達(dá)具有重要的意義。
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發(fā)表期刊：Nature Genetics
發(fā)表單位：柏林醫(yī)學(xué)系統(tǒng)生物學(xué)研究所
影響因子：41.307
發(fā)表時間：2022.07.21
DOI號：10.1038/s41588-022-01129-5
研究背景
成年哺乳動物的心臟損傷通常會導(dǎo)致永久性瘢痕。然而，成年斑馬魚心臟損傷后能有效再生，這使得斑馬魚成為研究心臟再生細(xì)胞和分子機制的理想模型。在模擬心肌梗塞的低溫?fù)p傷后，受傷的斑馬魚心臟會經(jīng)歷一個短暫的纖維化期。在此期間，受損的心肌會通過去分化和增殖進行再生，這與心肌梗死的某些方面相似。然而，在以往的斑馬魚心臟再生研究中，還沒有系統(tǒng)的數(shù)據(jù)來確定再生細(xì)胞的狀態(tài)和細(xì)胞類型的起源，對再生生態(tài)位的細(xì)胞組成、潛在的信號傳遞和相互作用的認(rèn)識仍不全面。目前對活化巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的定義嚴(yán)重依賴于轉(zhuǎn)基因，可能受到觀察偏差的影響，從而低估斑馬魚心臟再生過程中細(xì)胞狀態(tài)的復(fù)雜性。
材料方法
單細(xì)胞RNA-seq ：
表1 實驗樣本一覽表
空間轉(zhuǎn)錄組（Tomo-seq）：斑馬魚心房和心室一共100張切片，每張切片分別做RNA-seq
方法：scRNA-seq、Tomo-seq、熒光原位雜交和基于CRISPR-Cas9技術(shù)的譜系追蹤
研究結(jié)果
為了系統(tǒng)地識別健康和再生斑馬魚心臟中的細(xì)胞類型，作者對損傷前后不同階段的大約20萬個解離細(xì)胞進行了scRNA-seq（圖1a）。為了準(zhǔn)確得到細(xì)胞發(fā)育起源的相關(guān)信息，作者還應(yīng)用了一種基于CRISPR–Cas9技術(shù)的大規(guī)模平行譜系追蹤方法，通過注射Cas9和針對多拷貝轉(zhuǎn)基因(斑馬魚系中的dTomato：一種用于斑馬魚細(xì)胞追蹤和譜系分析的多光譜細(xì)胞標(biāo)記)的sgRNA，創(chuàng)建了作為譜系條形碼的“遺傳疤痕”來記錄早期發(fā)育中的譜系關(guān)系。
作者首先評估了健康和再生心臟中的細(xì)胞類型多樣性，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的聚類分析顯示了所有主要的心臟細(xì)胞類型。正如預(yù)期的那樣，觀察到成纖維細(xì)胞和免疫細(xì)胞在損傷后強烈增加（圖1b）。進一步檢查聚類數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，心臟的三個主要層:心外膜、心肌和心內(nèi)膜的細(xì)胞類型之間存在一個亞結(jié)構(gòu)。作者假設(shè)，由于心房和心室中這些細(xì)胞類型的功能差別，這種細(xì)胞類型的亞結(jié)構(gòu)可能存在空間差異。于是使用Tomo-seq方法（一種用冷凍切片機沿感興趣的軸對組織進行切片，然后在每個切片上進行RNA-seq的技術(shù)）進行空間分辨率轉(zhuǎn)錄組，并將空間數(shù)據(jù)解卷積為單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄譜，可以驗證一些細(xì)胞亞型在心房和心室富集（圖1c）。之后再通過物理分離心房和心室，使用scRNA-seq證實了這一發(fā)現(xiàn)（圖1d）。
圖1?再生心臟的細(xì)胞組成
作者進一步確定了心肌細(xì)胞中的一個轉(zhuǎn)錄亞結(jié)構(gòu)（圖2a）。除了以表達(dá)ATP合成和三羧酸循環(huán)相關(guān)基因(atp5pd和aldoaa)為特征的成年心肌細(xì)胞外，還檢測到一個較小的與心肌細(xì)胞發(fā)育相關(guān)的基因簇(ttn.1, ttn.2,?bves and synpo2lb)，以及nppa——此前已被證明是邊界區(qū)去分化心肌細(xì)胞的標(biāo)記基因。這些去分化心肌細(xì)胞是心臟再生的標(biāo)志，其數(shù)量在3 d.p.i.（受傷后天數(shù)）增加了(圖2a)，并與已建立的標(biāo)記基因nppa22部分共定位于7 d.p.i.。
作者注意到心臟再生中三個成熟的信號因子在成纖維細(xì)胞中高度富集:合成視黃酸的酶aldh1a2、心肌細(xì)胞有絲分裂原nrg1和再生細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)因子fn1a（圖2b）。為了更詳細(xì)地研究心臟成纖維細(xì)胞的多樣性，作者對成纖維細(xì)胞進行了亞群聚類。結(jié)果顯示出驚人的多樣性，有13個轉(zhuǎn)錄上不同的成纖維細(xì)胞聚類(圖2c)。這13個基因簇在ECM相關(guān)基因的表達(dá)譜上表現(xiàn)出明顯的差異（圖2d），但它們的轉(zhuǎn)錄組多樣性遠(yuǎn)不止于此——去除ECM相關(guān)基因后，可以高精度鑒定相同的成纖維細(xì)胞亞型。
圖2?心臟成纖維細(xì)胞的細(xì)胞類型多樣性
3. 心臟再生成纖維細(xì)胞的鑒定
為了集中分析那些可能是再生生態(tài)位一部分的成纖維細(xì)胞亞型，作者分析了損傷后細(xì)胞簇的動力學(xué)。col11a1a、col12a1a和nppc特征表達(dá)的3簇成纖維細(xì)胞在再生高峰期短暫出現(xiàn)?(3、 7 d.p.i.)，但在受傷前和再生完成后幾乎不存在。由于其短暫性，作者將這三個基因簇稱為細(xì)胞狀態(tài)，而不是細(xì)胞類型（圖3a）。為了對鑒定的成纖維細(xì)胞進行空間分辨，作者進行了熒光原位雜交證實了瞬時成纖維細(xì)胞狀態(tài)在邊界區(qū)以及損傷區(qū)的位置（圖3b）。之后發(fā)現(xiàn)nrg1在col12a1a成纖維細(xì)胞中特別高的表達(dá)，而fn1a幾乎只在col11a1a成纖維細(xì)胞中表達(dá)（圖3c）。作者推斷瞬時細(xì)胞狀態(tài)的潛在再生功能可能是由分泌因子驅(qū)動的。生物信息學(xué)分析顯示，與未損傷的對照組心臟相比，再生心臟的分泌組基因表達(dá)在3 d.p.i.和7 d.p.i.時增加（圖3d）。col11a1a和col12a1a成纖維細(xì)胞中分泌組基因的表達(dá)在所有檢測到的細(xì)胞簇中最高，且其分泌組基因包含在再生、形態(tài)發(fā)生和組織發(fā)育等方面具有功能的基因（圖3e）。
雖然作者對單細(xì)胞基因表達(dá)譜的時空分析強烈表明了瞬時成纖維細(xì)胞的再生功能，但還需要額外的實驗來驗證這一假設(shè)。為了從功能上評估瞬時col11a1a和col12a1a成纖維細(xì)胞的作用，作者使用硝基還原酶/甲硝唑（NTR/MTZ）系統(tǒng)進行靶向細(xì)胞剔除。在MTZ處理后的轉(zhuǎn)基因系Tg(-4kbcol12a1a:GAL4VP16;UAS:NTR:RFP)中，在7 d.p.i.時相較于對照，5 / 6的心臟顯示心肌細(xì)胞增殖減少，col12aa表達(dá)細(xì)胞減少（圖3g,h）。在30d.p.i.時，col12a1+細(xì)胞剔除顯著損害心臟再生（圖3i,j）。總之，作者確定了心臟再生過程中具有潛在再生作用的三種成纖維細(xì)胞狀態(tài):col11a1a、col12a1a和nppc成纖維細(xì)胞。基因細(xì)胞剔除數(shù)據(jù)強烈表明col12a1a表達(dá)細(xì)胞在再生生態(tài)位中發(fā)揮了作用。
圖3?心臟再生成纖維細(xì)胞的鑒定
4. 心外膜成纖維細(xì)胞的鑒定
接下來，作者想要闡明短暫成纖維細(xì)胞狀態(tài)的起源，以便更好地理解它們的激活機制。于是作者使用了基于CRISPR-Cas9技術(shù)的大規(guī)模平行譜系追蹤方法LINNAEUS。這種方法將細(xì)胞通過可遺傳的DNA條形碼(遺傳疤痕)標(biāo)記，它們由Cas9在早期發(fā)育過程中產(chǎn)生，其獨特的序列能夠識別疤痕產(chǎn)生時來自同一親本的細(xì)胞。通過對同一個單細(xì)胞的遺傳疤痕和轉(zhuǎn)錄組進行測序，作者便可以建立譜系樹，揭示這些細(xì)胞類型的共同發(fā)育起源（圖4a）。在譜系樹中，一個節(jié)點中的所有細(xì)胞共享相同的發(fā)育祖先（比如圖4a，B和C節(jié)點就共享相同發(fā)育祖先A），并且每個節(jié)點上不同瞬時細(xì)胞狀態(tài)下的每個細(xì)胞均可在相同的上一節(jié)點中對應(yīng)找到（比如在圖4a的譜系圖中節(jié)點C就包含了3種瞬時細(xì)胞狀態(tài)，這三種狀態(tài)下的所有細(xì)胞均可以在上一節(jié)點的對應(yīng)細(xì)胞狀態(tài)中找到）。作者還計算了不同樹節(jié)點中細(xì)胞類型比率之間的相關(guān)性，以確定哪些細(xì)胞類型通過譜系相關(guān)聯(lián)（圖4b）。譜系相關(guān)性聚類熱圖顯示，在3 d.p.i.時有4簇細(xì)胞類型，在7 d.p.i.時有7簇細(xì)胞類型。在這兩個時間點，所有的免疫細(xì)胞共享一個相同的譜系。此外，幾種成纖維細(xì)胞：col11a1a、col12a1a和構(gòu)成型成纖維細(xì)胞，它們和心外膜細(xì)胞聚集在一起，這表明這些成纖維細(xì)胞與心外膜細(xì)胞具有共同的發(fā)育起源（圖4c,d）。為了驗證這一結(jié)論，作者又構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因系TgBAC(tcf21:Cre-ERT2;ubi:Switch)。重組后，在7 d.p.i.表達(dá)的mCherry與內(nèi)源性表達(dá)的col12a1a共定位（圖4e），證實了瞬時col11a1a和col12a1a成纖維細(xì)胞為心外膜或心外膜衍生成纖維細(xì)胞的起源。為了進一步闡明短暫心外膜成纖維細(xì)胞狀態(tài)的起源，作者應(yīng)用了RNA速度分析方法，對心外膜譜系簇中所有心室細(xì)胞類型在3 d.p.i.和7 d.p.i.下的發(fā)育軌跡進行推斷（圖4f），得到了相同的結(jié)論。
圖4?心外膜成纖維細(xì)胞的鑒定
5. 心內(nèi)膜成纖維細(xì)胞的鑒定
瞬時nppc成纖維細(xì)胞和其他幾個成纖維細(xì)胞亞型(spock3、cfd和瓣膜成纖維細(xì)胞)在3 d.p.i.或7 d.p.i.時不屬于心外膜譜系，但與心內(nèi)膜以及彼此之間顯示中度正相關(guān)。基于相關(guān)性的分析有一個潛在的假設(shè)，即所有克隆體都會表現(xiàn)出相似的轉(zhuǎn)換率（圖5a），但是這種假設(shè)并不適用于所有細(xì)胞類型，于是作者引入條件概率開發(fā)了第二種算法（圖5b）。在3 d.p.i.時，不同成纖維細(xì)胞類型：col11a1a成纖維細(xì)胞、構(gòu)成型成纖維細(xì)胞、心外膜(心室)轉(zhuǎn)變?yōu)?em>col12a1a成纖維細(xì)胞類型的條件概率均大于0.9（圖5c）。在7 d.p.i. 時，不同的心內(nèi)膜細(xì)胞類型：心內(nèi)膜（心房）、心內(nèi)膜（心室）和心內(nèi)膜 ( frzb )轉(zhuǎn)變?yōu)?em>nppc成纖維細(xì)胞的條件概率均大于0.8，表明這種成纖維細(xì)胞類型與心內(nèi)膜之間存在譜系關(guān)系。為了驗證算法的真實性，作者構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因系Tg(fli1:Cre-ERT2; hsp70l:Switch)。在7 d.p.i.表達(dá)的EGFP與內(nèi)源性表達(dá)的nppc共定位（圖5e），證實了瞬時nppc成纖維細(xì)胞的心內(nèi)膜起源。RNA速度分析揭示了心室內(nèi)膜和nppc成纖維細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)錄相似性和潛在的過渡路徑（圖5f）。從單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中觀察到，與健康對照組心臟相比，心內(nèi)膜在7 d.p.i.時發(fā)生了激活反應(yīng)（圖5g）。
圖5?心內(nèi)膜成纖維細(xì)胞的鑒定
6. 典型Wnt信號通路作用的細(xì)胞解剖
作者發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞中表達(dá)了許多與Wnt信號有關(guān)的基因(配體、受體和調(diào)節(jié)劑)（圖6a），于是這啟發(fā)了他們?nèi)パ芯縒nt信號在斑馬魚心臟再生過程中的作用。一方面，Wnt通常被認(rèn)為是一種促增殖因子，Wnt的激活已被證明對斑馬魚鰭和脊髓再生有益。另一方面，Wnt信號通路在心肌細(xì)胞去分化和增殖中的作用存在爭議。于是，作者在斑馬魚心臟冷凍損傷后，使用特征良好的Wnt/β-catenin依賴的信號抑制劑IWR-1抑制典型的Wnt信號，并在3,7,15和30 d.p.i.觀察其影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號通路抑制導(dǎo)致心臟再生顯著延遲，與對照組相比，心肌纖維化延長，損傷面積增大（圖6b）。IWR-1處理后心臟的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示心肌細(xì)胞去分化延遲，與對照組相比，去分化心肌細(xì)胞數(shù)量在3 d.p.i.時減少，而在7 d.p.i.時未定位于損傷區(qū)域（圖6c）。Wnt抑制后，血管周細(xì)胞和所有心內(nèi)膜成纖維細(xì)胞(nppc、spock3和瓣膜成纖維細(xì)胞)的水平顯著降低，而其他短暫增加的成纖維細(xì)胞總體上保持在類似水平（圖6d）。通過熒光原位雜交也證實了，Wnt信號對于心內(nèi)膜成纖維細(xì)胞的激活是必需的，類似于所描述的Wnt在誘導(dǎo)小鼠內(nèi)皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化中的作用。
為了評估血管再生，作者對4d.p.i.下冠脈內(nèi)皮細(xì)胞(cECs)的增殖以及7 d.p.i.損傷區(qū)冠狀動脈的覆蓋范圍進行了定量分析。發(fā)現(xiàn)注射IWR-1后，cEC增殖在4 d.p.i.時有邊緣但不顯著的下降（圖6f,g）。然而，在7d.p.i.時，損傷區(qū)冠狀動脈覆蓋明顯減少（圖6h,j）。這些結(jié)果表明，Wnt抑制后觀察到的心臟再生減少至少部分是由血管再生缺陷介導(dǎo)的。這種缺陷似乎不是由cECs增殖減少引起的，而可能與血管再生的其他方面有關(guān)。
圖6 對典型Wnt信號作用的細(xì)胞剖析
總? 結(jié)
成年斑馬魚心臟損傷后具有很高的再生能力。然而，再生生態(tài)位的組成在很大程度上仍然難以捉摸。這篇文章基于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)和時空分析，解剖了再生斑馬魚心臟中激活細(xì)胞狀態(tài)的多樣性。觀察到損傷后出現(xiàn)的幾種具有成纖維細(xì)胞特征的瞬時細(xì)胞狀態(tài)，并概述了表達(dá)膠原-12的成纖維細(xì)胞的促再生功能。為了了解導(dǎo)致心臟再生的級聯(lián)事件，作者通過高通量譜系追蹤確定了這些細(xì)胞狀態(tài)的起源。最終發(fā)現(xiàn)激活的成纖維細(xì)胞有兩個不同的來源:心外膜和心內(nèi)膜。在機制上，確定Wnt信號作為心內(nèi)膜成纖維細(xì)胞反應(yīng)的調(diào)節(jié)器。總之，本文確定了促進心臟再生的特殊活化成纖維細(xì)胞狀態(tài)，從而為調(diào)節(jié)脊椎動物心臟再生能力開辟了可能的途徑。
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參考文獻(xiàn)
今天跟大家分享一篇少量樣本結(jié)合多組學(xué)數(shù)據(jù)聯(lián)合分析的研究報道，“彌漫性甲狀腺腫和橋本甲狀腺炎微環(huán)境中免疫細(xì)胞基因表達(dá)失調(diào)和代謝信號異常的全局調(diào)控網(wǎng)絡(luò)”，該文是百邁客合作客戶青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬煙臺毓璜頂醫(yī)院宋西成教授團隊發(fā)表在Frontiers?in?Immunology（IF=8.786）的研究成果，發(fā)表時間為2022年5月。百邁客為該研究提供了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、全轉(zhuǎn)錄組、全長轉(zhuǎn)錄組和代謝組的建庫測序服務(wù)。
研究背景
人類自身免疫性甲狀腺疾病?(AITD)?是最常見的器官特異性自身免疫性疾病，也是甲狀腺功能障礙和非地方性甲狀腺腫的最常見原因，主要表現(xiàn)為彌漫性甲狀腺腫（Graves’disease，GD）和橋本甲狀腺炎（Hashimoto’s?thyroiditis，HT）；HT和GD具有不同的臨床特征，但它們在組織損傷方面是相似的，包括體內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤。研究表明，T淋巴細(xì)胞及其特異性細(xì)胞因子作為免疫不可或缺的組成部分，在AITD的發(fā)生中起關(guān)鍵作用，例如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)和輔助T細(xì)胞17?(Th17)的失調(diào)、Th1/Th2失衡在AITD的發(fā)病機制中起著關(guān)鍵作用，但這些細(xì)胞亞群免疫功能障礙引起的致病分子機制在很大程度上仍未得到解釋。
本研究基于HT患者、GD患者和健康對照甲狀腺組織的單細(xì)胞RNA測序、全轉(zhuǎn)錄組測序、ONT全長轉(zhuǎn)錄組測序和代謝組測序數(shù)據(jù)，探討了HT和GD疾病微環(huán)境中基因表達(dá)失調(diào)和代謝信號異常的免疫細(xì)胞，構(gòu)建了免疫細(xì)胞的全局調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，為進一步了解HT和GD免疫紊亂和代謝異常介導(dǎo)的疾病機制、更好地干預(yù)和治療疾病提供了科學(xué)的理論指導(dǎo)和研究基礎(chǔ)。
研究思路
主要內(nèi)容
1、全轉(zhuǎn)錄組測序分析HT和GD的異常表達(dá)基因
為了鑒定HT組和GD組中異常表達(dá)的lncRNA和miRNA，分別進行了ONT全長轉(zhuǎn)錄組測序和全轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)。差異表達(dá)分析結(jié)果顯示，共檢測到6,153?個?lncRNA?s和?741?個?miRNAs?在?HT?患者中存在差異表達(dá)（圖?1A）；GD患者中檢測到5,492個lncRNAs?和?165?個?miRNAs?存在差異表達(dá)（圖?1B）；相關(guān)性分析結(jié)果驗證了本研究中兩種測序方法的檢測穩(wěn)定性（圖?1C,?D）。
圖1?HT和GD基因表達(dá)差異分析
2、HT和GD基因表達(dá)差異與異常免疫級聯(lián)和代謝信號傳導(dǎo)有關(guān)
對HT組和GD組顯著差異基因進行功能富集分析，結(jié)果顯示，HT組中顯著富集的通路為白細(xì)胞-細(xì)胞粘附、T?細(xì)胞活化和分化、細(xì)胞因子代謝過程和免疫反應(yīng)激活的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（圖?2A），而GD組中，則顯著富集的信號通路為白細(xì)胞-細(xì)胞粘附、激素代謝過程和的細(xì)胞趨化性（圖?2B）；此外，HT（圖?2C）和GD（圖?2D）均富含與甲狀腺疾病相關(guān)的信號通路，包括甲狀旁腺激素合成、甲狀腺激素分泌、甲狀腺激素信號通路作用和自身免疫性甲狀腺疾病；同時，HT和GD還富集了其他幾種免疫炎癥和代謝信號相關(guān)通路，包括細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、趨化因子信號通路、Th1和Th2細(xì)胞分化、NF-kappa?B信號通路、苯丙氨酸代謝、色氨酸代謝和酪氨酸代謝。
為了進一步確定代謝物在HT和GD中的作用，對HT組、GD組及對照組的代謝組數(shù)據(jù)進行差異代謝物分析及代謝通路富集分析（圖?2E,?F）。結(jié)果顯示，相較于對照組，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、苯丙氨酸代謝和類固醇生物合成的代謝通路在HT組中顯著激活（圖?2G(a)），而亞油酸代謝和類固醇激素生物合成代謝通路受到抑制（圖?2G(b)）；此外，類固醇激素生物合成、咖啡因代謝和花生四烯酸代謝通路在GD組中被激活（圖?2G(c)），而苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成以及亞油酸代謝通路受到抑制（圖?2G(d)）。
鑒于免疫反應(yīng)在HT和GD中的重要作用，利用GSEA方法進行免疫浸潤分析，進一步評估了樣本中免疫細(xì)胞的豐度，發(fā)現(xiàn)CD4?+T細(xì)胞、CD8?+?T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、Th1和Th2細(xì)胞均有不同程度的浸潤（圖?2H）。
圖2?HT和GD中失調(diào)的基因表達(dá)與異常的免疫級聯(lián)和代謝信號傳導(dǎo)有關(guān)
3、HT和GD中疾病微環(huán)境中CD4+?T細(xì)胞中基因表達(dá)失調(diào)和代謝信號異常
對單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的CD4+?T細(xì)胞亞群進行進一步分析，發(fā)現(xiàn)在HT、GD和對照組中細(xì)胞豐度存在明顯差異（圖?3A）。將bulk?RNA-seq數(shù)據(jù)中顯著差異表達(dá)的基因，與CD4+??T細(xì)胞的單細(xì)胞RNA-seq數(shù)據(jù)中的基因取交集，并對這些共表達(dá)的基因集進行功能富集分析；分析結(jié)果顯示，HT組中顯著差異富集的通路有甲狀腺激素信號通路、T?細(xì)胞受體信號通路、Th1和Th2細(xì)胞分化、Th17細(xì)胞分化、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用和NF-kappa?B信號通路（圖?3B）；而在GD組中，甲狀旁腺激素合成，分泌和作用、ECM-受體相互作用、嘌呤代謝、cAMP?信號通路、NF-kappa?B?信號通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用和T細(xì)胞受體信號通路顯著富集（圖?3C?)。GSEA富集分析結(jié)果顯示，HT組中細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用和T細(xì)胞受體信號通路顯著富集（圖?3D），但GD組中未觀察到顯著富集的通路。此外，氨基酸生物合成和嘌呤代謝相關(guān)的代謝通路在HT和GD組中均顯著富集。
圖3?HT和GD微環(huán)境CD4+?T細(xì)胞中基因表達(dá)失調(diào)和代謝信號異常
4、HT和GD疾病微環(huán)境中CD8+?T細(xì)胞中基因表達(dá)失調(diào)和代謝信號異常
對單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的CD8+??T細(xì)胞亞群進行進一步分析，發(fā)現(xiàn)在HT、GD和對照組中細(xì)胞豐度存在明顯差異（圖?4A）；與CD8+?T細(xì)胞亞群類似，將與bulk數(shù)據(jù)中共表達(dá)的基因集進行功能富集分析。結(jié)果顯示，在HT（圖?4B）和GD（圖?4C）中，顯著富集的通路有抗原加工和呈遞、Th1和Th2細(xì)胞分化、Th17細(xì)胞分化、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用和?NF-kappa?B?信號通路；甲狀旁腺激素的合成、分泌和作用及白細(xì)胞跨內(nèi)的遷移途徑在HT組顯著富集；而GD組中，嘌呤代謝和cAMP信號通路顯著富集。GSEA分析結(jié)果顯示，HT組中細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用和?NF-kappa?B?信號通路顯著富集（圖?4D），而在GD組中未發(fā)現(xiàn)顯著富集的通路；嘌呤代謝信號通路在HT組和GD組中均富集。
圖4?HT和GD微環(huán)境CD8+?T細(xì)胞中基因表達(dá)失調(diào)和代謝信號異常
5、HT和GD微環(huán)境巨噬細(xì)胞中基因表達(dá)失調(diào)和代謝信號異常
對單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的CD8+?T細(xì)胞亞群進行進一步分析，發(fā)現(xiàn)?HT、GD?和對照組中巨噬細(xì)胞豐度存在明顯差異（圖?5A）。同樣地，將與bulk數(shù)據(jù)共表達(dá)的基因集進行功能富集分析；分析結(jié)果顯示，HT組（圖?5B）和GD組（圖?5C）顯著富集的信號通路有甲狀旁腺激素的合成，分泌和作用、抗原加工和呈遞、Th1和Th2細(xì)胞分化、Th17細(xì)胞分化、NOD樣受體信號通路、NF-kappa?B信號通路和細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用；T組中，甲狀腺激素信號通路和Toll樣受體信號通路顯著富集；GD組中，吞噬體、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成途徑顯著富集。GSEA富集分析結(jié)果顯示，HT組中細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、NF-kappa?B信號通路、Th1和Th2細(xì)胞分化以及Th17細(xì)胞分化通路顯著富集（圖?5D)，而GD組中沒有發(fā)現(xiàn)類似的富集通路；嘌呤和苯丙氨酸代謝信號通路分別在HT組和GD組中顯著富集。
圖5?HT和GD微環(huán)境巨噬細(xì)胞中基因表達(dá)失調(diào)和代謝信號異常
6、HT和GD微環(huán)境中T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析
為了確定HT和GD疾病微環(huán)境的細(xì)胞間調(diào)節(jié)機制，對CD4+?T細(xì)胞、CD8+?T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞進行iTALK細(xì)胞通訊分析。分析結(jié)果顯示，HT（圖?6A）和GD（圖?6B）中配體-受體對的豐度存在顯著差異；HT組中，微環(huán)境中的T細(xì)胞主要通過IL16-CCR5、FGF10-FGFR1、CXCL13-CXCR3和CD70-CD27受體配體對靶向巨噬細(xì)胞，激活細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用和T細(xì)胞受體信號通路（圖?6C）；GD組中，微環(huán)境T細(xì)胞主要通過CXCR3-CXCL10、PKM-CD44和?CCL21-CCR7受體配體對靶向巨噬細(xì)胞，激活EMC受體相互作用和NF-kappa?B信號通路（圖?6D）；相較于對照相，調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因（CCL21、CCR7、CD4、CD27、CD70、CXCL13、ICOS、IL-16、LAT、TNF及IL16），經(jīng)qPCR實驗驗證，在HT組?(圖?6E?)?和GD?(圖?6F?)均顯示存在顯著差異表達(dá)。
圖6?HT和GD疾病微環(huán)境T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的全局調(diào)控網(wǎng)絡(luò)
研究小結(jié)
本研究利用轉(zhuǎn)錄水平和代謝水平的測序數(shù)據(jù)聯(lián)合，在單細(xì)胞水平上鑒定了HT和GD疾病微環(huán)境中基因表達(dá)失調(diào)和代謝信號異常的免疫細(xì)胞；同時，構(gòu)建了免疫細(xì)胞的全局調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為HT和GD疾病機制介導(dǎo)的免疫失調(diào)和代謝異常提供了新的視角。
參考文獻(xiàn)
Zheng,?Haitao?et?al.?“A?Global?Regulatory?Network?for?Dysregulated?Gene?Expression?and?Abnormal?Metabolic?Signaling?in?Immune?Cells?in?the?Microenvironment?of?Graves’?Disease?and?Hashimoto’s?Thyroiditis.”?Frontiers?in?immunology?vol.?13?879824.?26?May.?2022,?doi:10.3389/fimmu.2022.879824
]]>2月，單細(xì)胞測序技術(shù)繼續(xù)為腫瘤、疾病、發(fā)育、免疫等生物學(xué)問題的深入探索帶來新的突破。本期為大家介紹2月國內(nèi)學(xué)者借助單細(xì)胞測序技術(shù)在發(fā)育研究方面新的探索與發(fā)現(xiàn)，希望這些研究能為更多的科研工作者帶來關(guān)于利用前沿技術(shù)深入解析胚胎發(fā)育、干細(xì)胞分化等研究帶來思考和啟發(fā)。
2月1日，第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院的研究團隊在《Cell?Mol?Gastroenterol?Hepatol》（IF=7.076）在線發(fā)表了題為“Notch調(diào)節(jié)的c-kit陽性肝竇內(nèi)皮細(xì)胞有助于肝臟分區(qū)和再生”的研究成果。該研究通過建立PHx小鼠模型誘導(dǎo)肝再生，并對肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（SECs）?進行單細(xì)胞?RNA?測序，發(fā)現(xiàn)c-kit+SECs?通過Wnt2促進肝臟分區(qū)和再生，并受?Notch?信號調(diào)節(jié)。（DOI:10.1016/j.jcmgh.2022.01.019）
2月3日，中國科學(xué)院北京基因組研究所的研究團隊在《Genomics?Proteomics?Bioinformatics》（IF=7.051）發(fā)表了題為“單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析揭示間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞異質(zhì)性”的研究成果。該研究通過對源自骨髓和沃頓氏膠的間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）?進行單細(xì)胞?RNA測序，繪制了這五個MSC亞群的發(fā)育軌跡，并確定了兩個在自我更新和免疫調(diào)節(jié)方面具有潛在功能的亞群。（DOI:10.1016/j.gpb.2022.01.005）
2月4日，南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院的研究團隊在《Front?Immunol》（IF=5.085）發(fā)表了題為“CCR2巨噬細(xì)胞促進正畸牙齒運動和牙槽骨重塑”的研究成果。該研究利用單細(xì)胞RNA測序研究牙槽骨重塑過程中巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性，發(fā)現(xiàn)機械力誘導(dǎo)的由?NF-κB通路介導(dǎo)的Ccr2巨噬細(xì)胞簇的功能轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致促炎反應(yīng)和骨重塑。（DOI:10.3389/fimmu.2022.835986）
2月4日，上海交通大學(xué)的研究團隊在《New?Phytol》（IF=8.512）發(fā)表了題為“水稻單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜定義了水稻小花和花序分生組織的發(fā)育軌跡”的研究成果。該研究使用單細(xì)胞?RNA?測序?qū)λ净ㄐ蜻M行分析，構(gòu)建了涵蓋早期生殖發(fā)育過程中花序到小花轉(zhuǎn)變的基因組規(guī)模的基因表達(dá)資源，重建了小花和腋生分生組織的分化軌跡，鑒定了高度異質(zhì)性年輕花序中的離散細(xì)胞類型和調(diào)節(jié)因子組，并通過原位雜交和熒光標(biāo)記線進行驗證。（DOI:10.1111/nph.18008）
2月8日，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)的研究團隊在《Neuron》（IF=14.415）發(fā)表了題為“神經(jīng)源性神經(jīng)肽Y微調(diào)脾免疫反應(yīng)”的研究成果。該研究通過單細(xì)胞測序發(fā)現(xiàn)敲除大鼠腎上和腹腔神經(jīng)節(jié)（SrG-CG）中的?NPY?基因改變了脾淋巴細(xì)胞的增殖和活化，證明了NPY是一種用于神經(jīng)免疫系統(tǒng)串?dāng)_的古老語言，可用于緩解感染期間的炎癥風(fēng)暴和調(diào)節(jié)自身免疫性疾病中的免疫平衡。（DOI:10.1016/j.neuron.2022.01.010）
2月15日，河南大學(xué)的研究團隊在《Plant?Cell》（IF=9.618）發(fā)表了題為“玉米單核轉(zhuǎn)錄組全面描述了控制草氣孔運動和發(fā)育的信號網(wǎng)絡(luò)”的研究成果。該研究開發(fā)了植物單核RNA測序平臺，并用它鑒定玉米表皮中成熟和發(fā)育氣孔的細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在氣孔發(fā)育和啞鈴形保衛(wèi)細(xì)胞形成中保衛(wèi)細(xì)胞和輔助細(xì)胞之間存在更復(fù)雜的關(guān)系，證實了已知特征并闡明了氣孔發(fā)育的關(guān)鍵參與者。（DOI:10.1093/plcell/koac047）
2月22日，南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究團隊在《Proc?Natl?Acad?Sci?USA》（IF=9.412）發(fā)表了題為“以單細(xì)胞分辨率破譯人類薄子宮內(nèi)膜的子宮內(nèi)膜生態(tài)位”的研究成果。該研究利用單細(xì)胞RNA測序表征人類子宮內(nèi)膜的細(xì)胞類型、它們的通訊以及增殖期正常和薄子宮內(nèi)膜中子宮內(nèi)膜生長的潛在機制，提供了對子宮內(nèi)膜再生和生長治療薄子宮內(nèi)膜的治療策略的見解。（DOI:10.1073/pnas.2115912119）
2月23日，中國科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所的研究團隊在《Adv?Sci》（IF=15.84）發(fā)表了題為“發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用對椎間盤穩(wěn)態(tài)和退化至關(guān)重要的產(chǎn)后髓核祖細(xì)胞”的研究成果。該研究對髓核（NP）進行單細(xì)胞RNA測序，構(gòu)建了一個新的NP細(xì)胞圖譜，確定了具有再生潛力的常駐NP祖細(xì)胞，并揭示了椎間盤退變的有希望的診斷和治療靶點。（DOI:10.1002/advs.202104888）
2月24日，烏得勒支大學(xué)、香港中文大學(xué)-四川大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)聯(lián)合實驗室的研究團隊在《Nat?Commun》（IF=12.121）發(fā)表了題為“人類腦室下區(qū)祖細(xì)胞的單細(xì)胞分析將?SFRP1?識別為重新激活祖細(xì)胞的目標(biāo)”的研究成果。該研究分離出來自老年人腦室下區(qū)（SVZ）?的祖細(xì)胞進行單細(xì)胞RNA測序，據(jù)揭示了老年人SVZ?的祖細(xì)胞作為晚期少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞的身份，將Wnt通路拮抗劑SFRP1確定為促進老年人SVZ祖細(xì)胞靜止的可能信號。（DOI:10.1038/s41467-022-28626-9）
2月25日，溫州醫(yī)科學(xué)大學(xué)的研究團隊在《Acta?Pharmacol?Sin》（IF=6.150）發(fā)表了題為“抗糖尿病藥物canagliflozin阻礙小鼠骨骼肌再生”的研究成果。研究通過體內(nèi)外實驗發(fā)現(xiàn)卡格列凈會損害固有的肌源性再生，并利用單細(xì)胞RNA測序揭示了LARS2通過影響線粒體結(jié)構(gòu)和活性在調(diào)節(jié)成肌細(xì)胞分化和肌肉再生中發(fā)揮關(guān)鍵作用。該研究的單細(xì)胞RNA測序和分析由百邁客提供。（DOI:10.1038/s41401-022-00878-7）
2月24日，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)的研究團隊在《Genomics》（IF=6.205）發(fā)表了題為“單細(xì)胞測序揭示了絨山羊毛囊再生中真皮乳頭細(xì)胞的新存在形式”的研究成果。該研究對具有明顯毛囊周期性的絨山羊進行scRNA測序，構(gòu)建了真皮乳頭細(xì)胞譜系分化軌跡，揭示了參與細(xì)胞命運決定的關(guān)鍵基因、信號和功能和毛囊再生的分子景觀。（DOI:10.1016/j.ygeno.2022.110316）
總?結(jié)
在發(fā)育方面，單細(xì)胞RNA測序和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)等新興技術(shù)正在為理解協(xié)調(diào)細(xì)胞命運決定的結(jié)構(gòu)和組織模式的分子調(diào)控提供新的視角。從2月發(fā)表的文章可以看出，更多物種、更多器官的發(fā)育分化正在被解析。
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