研究背景
在植物中miRNA是源自有發夾結構單鏈前體的內源性小RNA。miRNA和其靶基因的進化代表了一種動態的基因表達通路，它們在決定植物不同器官發育中起基礎性的作用。本文利用高通量小RNA測序的手段研究了山茶花5個器官的miRNA空間表達譜。

實驗設計

材料：Camellia
取樣組織：五個組織材料（幼嫩葉片、雄蕊、花瓣、心皮和花芽），三個生物學重復
測序策略：百邁客Illumina HiSeq? 2500 ，SE36
測序數據量：每個樣本測了18.9~28.2M的數據量

設計思路：

研究結果
1、山茶花5個組織保守miRNA分析和新miRNA鑒定
miRDeep2軟件鑒定175個潛在的miRNA。長度分布分析顯示21和22bp的miRNA豐度*高；對成熟miRNA的堿基偏好性分析：21和22bp的miRNA首位堿基偏好于“U”；23和24bp的miRNA首位堿基偏好于“A”。

miRNA長度分布

miRNA堿基偏好性

2、山茶花中MIR160家族的結構和進化分析
將成熟的miRNA比對到植物的ncRNA Database鑒定到19個miRNA。以MIR160家族為例進行系統進化分析：基于pre-miRNA序列來構建MIR160家族系統進化樹。結果顯示保守的c38436.graph_c0_79977與來自葡萄、楊樹、木薯和蓮花的MIR160形成了一個分枝，這也與山茶花的進化地位相一致。

miRNA 160系統進化樹

3、組織間miRNA差異表達分析

組間差異表達miRNA維恩圖

4、組織特異性miRNA鑒定
對不同組織miRNA表達情況繪制聚類熱圖，大部分miRNA在不同組織中特異表達。miRNA表達聚類熱圖顯示一些明顯有著不同表達模式的亞簇，在此主要關注了雄蕊和心皮所特異的2個亞簇。對雄蕊中特異表達的miRNA靶基因進行GO注釋，顯著富集GO term為“DNA intergration ”和“氧化還原”。

miRNA表達量聚類熱圖及GO注釋

5、miRNA-靶基因的表達相關性驗證
選取6個miRNA及其靶基因進行表達驗證，發現4對表現出負相關的關系。例如miRNA167靶向2個SPL基因，用qPCR進行驗證，結果顯示出強的負相關關系。

miRNA及靶基因表達量相關性

6、山茶花中家系特異的miRNAs
(1).為了鑒定山茶花中家系特異miRNA家族，對不同植物中的miRNA家族構建進化樹。發現2個葡萄特異的miRNA家族出現在山茶花中，其中miR3633是高豐度和高識別度的，表明它出現在葡萄和山茶花分化之前。

miRNA家族進化樹

(2).鑒定到12個山茶花家系特異miRNA，將其前體序列與NCBI中山茶花和葡萄轉錄組數據庫進行比對。在葡萄數據集里沒有發現相應的miRNAs，但是大部分都出現在其他山茶花種里，說明這12個miRNAs是以家系特異的方式進化的。

文章亮點

1：材料選擇；
山茶花是觀賞植物，因其在不同類型重瓣上產生額外的花瓣形成它獨特的觀賞價值。了解其花器官發育的分子機制有助于新品種的培育。

2：深度數據挖掘，實驗驗證；
從組織特異性和發育調控方面，鑒定了組織特異性保守miRNA，深入進行靶基因功能注釋富集分析揭示其參與器官形成的機制；重點關注控制花器官發育的miRNA-靶基因調控機制，并選擇一些關鍵miRNA-靶基因進行了實驗驗證，為miRNA-靶基因環狀調控方式提供了依據。

3：新的分析角度；
從進化角度對山茶花屬的miRNA進行了分析，描述了山茶花屬miRNA家系特異型的進化方式。

實驗結果

開花誘導在蘋果樹生命周期中發揮非常重要的作用，但是年輕的蘋果樹往往容易產生低質量的數量少的花芽。嫩枝彎曲可以促進產生較多的花芽，因此嫩枝彎曲成為蘋果樹一個非常重要的栽培性狀。樹嫩枝彎曲會產生一種新的長距離信號，從而改變樹的生長和發育。但是，響應嫩枝彎曲發生的花芽生長和開花誘導的分子調控機制并不清楚，尤其是miRNA是否在其調控中發揮作用以及具體的機制如何。本研究關注在花芽發育、開花誘導和發育、響應嫩枝彎曲過程中miRNA的潛在作用。

研究目的

解析蘋果樹響應嫩枝彎曲時，植物激素和miRNA協同調控花芽生長和開花誘導的分子機制，有助于解決年輕蘋果樹低質量花芽的問題。

材料方法

1.實驗材料：
生長六年大小的富士蘋果樹，分兩組進行嫩枝彎曲（110度）、對照處理（垂直嫩枝），分別在開花誘導的初期（early stage，ES）、中期（Middle stage，MS）和晚期（Later stage，LS）取花芽，分別提取RNA進行小RNA測序，6個花芽組織RNA混樣進行降解組測序。
2.測序方法：
小RNA seq，Biomarker Illunima Hiseq 2000 platform

技術路線

實驗結果

1. 富士蘋果樹在開花誘導時期響應嫩枝彎曲后的花芽生長
首先，研究富士蘋果樹在開花誘導時期，嫩枝彎曲處理后花芽生長情況。無論是對照還是嫩枝彎曲處理，從發育早期（ES）到晚期（LS），花芽的長度、寬度、干重都增加了。但是，嫩枝彎曲明顯增加了花芽的大小。此外，通過檢測花芽生長速率發現，花芽大小變化主要發生在花芽誘導的早期，即ES到MS時期；而且，在嫩枝彎曲處理下花芽生長速率明顯增加了。實驗結果還顯示，嫩枝處理組比對照組的開花速率明顯增大了。

2. 開花誘導時期花芽中激素含量的變化。
分別在開花誘導的三個時間點（ES, MS, LS），對嫩枝彎曲處理組和對照組的花芽中激素（生長素，AUX；脫落酸，ABA；細胞分裂素，CK；赤霉素，GA）含量進行檢測。分析了在嫩枝彎曲組合對照組，開花誘導過程中各種激素含量的變化。

3. 小RNA和降解組文庫構建和測序。
為了研究嫩枝處理和對照組在ES、MS和LS時期小RNA的情況，構建了6個miRNA文庫（CES, CMS, CLS, BES, BMS, BLS）并用Illunima Hiseq 2000進行了測序。總共獲得了14 095 388, 14 106 904, 15 242 433, 13 259 311, 15 969 504 和13 523 103 raw reads。此外，對這六個組織提取的總RNA構建了降解組文庫并進行了測序，總共獲得了30 762 927 (93.08%) clean reads。分別對文庫進行了插入片段大小分布的評估，對sRNA的長度進行了統計分析。

4. 已知miRNA的鑒定和表達模式分析。
為了鑒定蘋果中已知的miRNA，用BLASTN將這六個花芽的sRNAs比對到miRBase 18.0 和植物miRNA數據庫中。總共獲得了屬于41個miRNA家族的195個已知的miRNA。然后對已知miRNA的表達量進行了分析。

Fig1. 差異表達已知miRNA維恩圖

對同一處理不同發育時期樣品間（CMS vs CES, CLS vs CMS, CLS vs CES, BMS vs BES, BLS vs BMS and BLS vs BES）篩選了差異表達miRNA并繪制了維恩圖。結果顯示，其中42個miRNA下調表達，20個miRNA上調表達。對不同處理相同發育時期樣品間（BES vs CES, BMS vs CMS and BLS vs CLS）篩選到124個差異表達miRNA，相對對照組，嫩枝彎曲處理組中68個下調表達，27個上調表達。

5. 新miRNA的鑒定和表達模式分析。
用栽培種蘋果（Malus domestica Borkh）作為參考基因組來預測潛在的新miRNA，共鑒定到137個新miRNA。對同一處理不同發育時期樣品間（CMS vs CES, CLS vs CMS, CLS vs CES, BMS vs BES, BLS vs BMS and BLS vs BES）新miRNA進行差異表達分析并繪制了維恩圖。結果顯示，其中34個新miRNA隨著發育時期上調表達，24個新miRNA在嫩枝彎曲處理組表達高于對照組，23個新miRNA在對照組表達明顯高于嫩枝彎曲處理組。

對嫩枝彎曲處理組和對照組間的31個差異表達新miRNA進行表達層次聚類分析。結果顯示，根據表達模式可分為5個亞簇。其中Cluster 1中的6個新miRNA在嫩枝彎曲組表達量均高于對照組。Cluster 5中的新miRNA表達模式則與Cluster 1中相反。其他三簇中的19個新miRNA，無論在對照組還是嫩枝彎曲處理組，展現出較低的表達水平。

Fig2. 差異表達新miRNA聚類熱圖

6. 已知和新miRNA的靶基因分析。
為了研究鑒定的已知和新miRNA參與的生物學過程，以及分析嫩枝彎曲調控開花誘導的分子機制，通過降解組來鑒定miRNA的靶基因。上文的分析顯示，在對照組和嫩枝彎曲組之間篩選到了41個家族195個已知miRNA。對這些已知miRNA以及它們目標切割位點的具體分布信息進行了分析。同時，鑒定了31個差異表達新miRNA的40個靶標。

新miRNA調控的靶基因包括一些轉錄因子和調控蛋白。如，新m1736-3p的靶基因為編碼一個myb-like的HTH轉錄因子家族蛋白（DUO1）。一些新miRNA調控的靶基因與植物激素相關，如新m1791-5p調控的靶基因為參與CK信號轉導途徑的細胞分裂素響應因子CRF4。此外，一些新miRNA的靶基因參與糖信號轉導和代謝，如新miR1316-5p調控靶基因BGAL3。

7. 定量RT-PCR鑒定與AUC、ABA、控制開花相關的差異表達miRNA和靶基因
為了驗證miRNA測序結果的準確性，以及分析在不同發育時期（ES-MS-LS）miRNA和靶基因的表達水平，我們檢測了在響應嫩枝彎曲時與IAA、ABA、控制開花相關的miRNA和靶基因的表達模式。結果顯示，與IAA、ABA信號轉導相關的miRNA和靶基因可能參與調控響應嫩枝彎曲時蘋果花芽的形成。

創新點

1.蘋果樹嫩枝彎曲可以促進產生較多的花芽，嫩枝彎曲是蘋果樹一個非常重要的栽培性狀，研究解析蘋果樹響應嫩枝彎曲的分子機制，有助于解決年輕蘋果樹低質量花芽的問題。
2.結合降解組的數據來分析鑒定miRNA的靶基因，更具有說服力。
3.分析了嫩枝彎曲誘導開花過程中激素含量的變化，并集合miRNA測序數據針對性地分析了激素相關基因的調控作用，深入解析了分子機制。
4.大量qRT-PCR實驗對miRNA和降解組測序數據的驗證。

參考文獻

[1] Libo Xing, Dong Zhang, Caiping Zhao, Youmei Li, Juanjuan Ma, Na An and Mingyu Han, (2015) Shoot bending promotes flower bud formation by miRNA-mediated regulation in apple (Malus domestica Borkh.) Plant Biotechnology Journal, pp. 749–770.

實驗材料

大豆“Taiwan 75”培養在正常條件下，第一真葉期的幼苗分為對照組和處理組。對照組—25°C（12h），17°C（12h），處理組—4°C（24h）。設置3次生物學重復。

研究結果

1.sRNA測序數據統計
首先，對大豆4°C處理組（3h、6h、9h、12h、24h和36h）及對照組進行相對生長速率（RGR）和MDA含量的檢測。發現在24h時，對照組和處理組RGR和MDA含量明顯不同。因此，選擇冷脅迫24h進行sRNA測序。

對照組和處理組分別獲得6559098和8273245 clean reads。長度為21nt所占比例*高（圖1A）。非冗余的reads，長度分布統計可以看出24nt所占比例*高，在對照組和處理組中分別為68.4%和59%（圖1B）。

圖1.sRNA長度分布圖

2.鑒定大豆中已知的miRNA
共鑒定到已知的434個miRNA，屬于133個家族。這些miRNA包括保守miRNA和種間特異性miRNA。保守miRNA在植物發育過程和響應脅迫上起到重要作用。通過同源比對鑒定大豆中保守的miRNA家族。例如miR156，miR160，miR164等在很多植物物種中都是高度保守的。此外，找到一些非保守miRNA，例如miR3522,表明他們可能參與大豆的物種進化。

3.預測大豆中新的miRNA
根據miRNAs前體的發夾結構來預測miRNAs，找到3個預測的miRNA并鑒定折疊成的二級結構。

4.驗證大豆中預測的miRNA
為了驗證測序結果，利用qRT-PCR分析miRNA表達情況。選擇了35個miRNA（33個已知miRNA，2個預測miRNA）進行qRT-PCR分析。線性回歸分析測序結果和qRT-PCR結果相關性系數為0.8048，表明miRNA-Seq和qRT-PCR結果相一致。盡管miRNA-Seq和qRT-PCR結果在√確的倍數方面有些差異，這可能是由于2種實驗結果敏感性和特異性的不同導致的，但是miRNA表達趨勢是一致的。

圖2.qRT-PCR結果

5.miRNA靶基因鑒定
利用降解組測序鑒定miRNA降解的靶基因。共獲得12283683條raw reads，2623291條非冗余raw reads。共鑒定到898個轉錄本是54個miRNA家族的靶基因。本研究發現miRNAs可以降解2個甚至更多的靶基因，與之前的研究相似。例如，gma-miRNAs可以沉默屬于SBP家族的15個基因，脫落酸響應結合因素蛋白家族和2個基因，2個轉錄因子等。而且，有7個轉錄本受到多個miRNAs的調控。

6.鑒定大豆冷脅迫下相關的miRNA
對miRNA進行差異表達分析，共鑒定到32個miRNA家族的51個miRNA差異表達。在冷脅迫下有30個下調表達，21個上調表達。

對相應靶基因進行功能注釋來研究差異表達的miRNA可能行使的功能。差異表達的miRNA可以分為四類。第一類包括miRNA家族（miR156、miR164、miR169、miR4412和miR5327），靶基因為轉錄因子SBP、NAC、NFY、GRAS和bHLH，參與調控基因表達和信號傳導。第二類包括miR4411，其對應靶基因涉及抵御疾病。第三類包括miR5761、miR159、miR5667、miR1535、miR511、miR4382和miR4416，其對應靶基因參與植物生長發育中的適應性。為了進一步確認冷脅迫下miRNA和靶基因的關系，選擇了5個miRNAs及其靶基因進行qRT-PCR驗證。結果表明，在冷脅迫下miRNA-164a，miRNA-4411和miRNA-169e上調。相反的，他們的靶基因NAC、DRP和NFY顯著下調。說明miRNA和對應靶基因呈負相關性。

圖3.miRNA和對應靶基因qRT-PCR圖

為了近一步確認這些差異表達miRNA的功能，對靶基因進行GO分析。靶基因共參與了56個分子功能terms，37個生物學過程terms和7個細胞組分terms。在分子功能分類下，ATP結合、蛋白結合、組蛋白結合等terms是顯著富集的。超過35%miRNAs的靶基因參與了生物學過程途徑。

圖4.GO注釋

結 論
首次研究大豆冷脅迫下miRNA調控基因表達情況。利用降解組測序鑒定到了上百個靶基因，揭示miRNAs和靶基因之前的相互關系。盡管miRNAs調控機制十分復雜，目前還不是十分清楚，本次研究完善了miRNA數據庫，為研究大豆和其他物種的基因調控網絡提供了重要基礎。也發現了51個響應冷脅迫的miRNAs。

文章亮點
1.處理時間點的選擇上進行了預實驗，設置多個時間梯度進行處理并進行生理指標測定，最終選擇變化較為明顯的時期。選樣時間點有理有據。
2.利用降解組測序z確鑒定miRNA降解的mRNA。

參考文獻
[1] Xu S, Liu N, Mao W, et al. Identification of chilling-responsive microRNAs and their targets in vegetable soybean (Glycine max L.)[J]. Scientific Reports, 2016, 6.